杜克大学护理学院 基于CRISPR的基因网络激活涉及人类干细胞成为神经元细胞,导致产生具有神经元形状和标记的细胞(左)和增强的功能和电生理特性,包括更频繁地产生更多的动作电位(右)
学分:杜克大学格斯巴赫实验室 杜克大学的一组生物医学工程师通过掌握基因调控网络的语言,创造了一种将干细胞转化为所需细胞类型的新方法
将干细胞编程为其他类型的细胞并不是一个新想法
几种方法已经存在,但是结果还有待改进
通常,程序化干细胞在实验室培养时不会正确成熟,因此为实验寻找成年神经元细胞的研究人员最终可能会选择胚胎神经元,这将无法模拟晚发性精神疾病和神经退行性疾病
“这些细胞乍一看似乎是对的,”杜克大学哲学博士乔希·布莱克说
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在查尔斯·格斯巴赫实验室领导这项工作的学生说,“但是他们经常缺少一些你想要的细胞的关键特性
" 杰斯巴赫是鲁尼家族生物医学工程副教授,也是先进基因组技术中心主任,他领导的实验室利用CRISP基因编辑技术,创造了一种方法来识别哪些转录因子——基因活动的主要控制者——对制造一个好的神经元至关重要
他们的作品出现在12月
1在《细胞报告》中,展示了这种方法制造成熟的成年神经元的潜力,但它可以应用于任何细胞类型的编程
CRISPR技术最常用于编辑DNA序列,被称为“基因组编辑”,在这种技术中,Cas9蛋白与一个引导RNA结合,该引导RNA指导Cas9在特定位置切割DNA,从而导致DNA序列的变化
“脱氧核糖核酸编辑已经被广泛用于改变基因序列,但这在基因关闭的情况下没有帮助,”格斯巴赫说
然而,一种失活的Cas9 (dCas9)蛋白会附着在DNA上而不会切割它
事实上,如果没有另一个分子附着在它上面,它通常什么也做不了
格斯巴赫和他的同事之前已经报道了多种方法将不同的分子域连接到dCas9蛋白上,这将告诉细胞打开一个基因并重塑染色质结构
当布莱克加入格斯巴赫的实验室时,他对使用这些工具打开基因感兴趣,这些基因可以将一种细胞类型转化为另一种细胞类型,从而创建更好的疾病模型
2016年,布莱克和格斯巴赫报道了一种使用基于CRISPR的基因激活剂打开基因网络的方法,该基因网络将成纤维细胞(一种容易获得的构成结缔组织的细胞类型)转化为神经元细胞。
这项研究的目标是已知与神经元规格相关的基因网络,但没有产生具有制作有效疾病模型所需所有特性的细胞
然而,产生这些所需细胞的正确基因网络是未知的,在人类基因组中有成千上万种编码的可能性
因此布莱克和格斯巴赫设计了一个策略,在一个实验中测试所有的网络
他们从多能干细胞开始,因为这种细胞类型应该能够成为人体内的任何其他细胞
为了用干细胞制造成熟的神经元,研究小组设计了干细胞,一旦它们变成神经元,就会发出红色荧光
荧光越亮,对神经元命运的推动越强
然后,他们建立了一个汇集了数千个导向核糖核酸的文库,这些导向核糖核酸针对人类基因组中编码转录因子的所有基因
转录因子是基因网络的主要调节者,因此为了制造所需的神经元,它们必须开启所有正确的转录因子
他们将CRISPR基因激活剂和导向RNA文库引入干细胞,使每个细胞只接收一个导向RNA,从而开启其特定的相应转录因子基因靶标
然后,他们根据细胞变红的程度对细胞进行分类,并对最红和最红细胞中的引导核糖核酸进行测序,这些核糖核酸告诉他们哪些基因在启动时使细胞或多或少具有神经元性
当他们分析了用导向核糖核酸工程改造的干细胞的基因表达时,结果表明相应的细胞产生了更特异、更成熟的神经元类型
他们还发现了当同时瞄准时一起工作的基因
此外,该实验揭示了对抗干细胞的神经元承诺的因素,当他们使用基于CRISPR的这些基因的阻遏物时,他们也可以增强神经元的规格
然而,这些结果都只是测量神经元的标记
为了知道这些工程细胞是否真的重现了更成熟神经元的功能,他们需要测试它们传输电信号的能力
为此,他们求助于斯科特·索德林教授,乔治·巴特·盖勒分子生物学研究杰出教授和杜克大学细胞生物学系主任
索德林实验室的研究生沙塔克西·杜贝(Shataakshi Dube)使用了一种被称为膜片钳电生理学的技术来测量新形成的神经元内部的电信号
通过用一根非常小的吸管在细胞上戳一个小洞,她可以观察神经元内部,看看它是否在传递被称为动作电位的电信号
如果是这样,研究小组知道神经元细胞已经成熟
事实上,被设计来激活一对特定转录因子基因的神经元在功能上更加成熟,更频繁地发出更多的动作电位
“我对这些干细胞会变成怎样的神经元很好奇,但持怀疑态度,”杜贝说,“但看到这些程序化细胞看起来和正常神经元有多像,这是很了不起的
" 从干细胞到成熟神经元细胞的过程需要7天,与其他需要数周或数月的方法相比,大大缩短了时间
这一更快的时间表有可能显著加快神经疾病新疗法的开发和测试
创造更好的细胞将在许多方面帮助研究人员
像阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和精神分裂症这样的疾病最常发生在成人身上,并且很难研究,因为在实验室中制造合适的细胞是一项挑战
这种新方法可以让研究人员更好地模拟这些疾病和其他疾病
它也有助于药物筛选,因为不同的细胞对药物的反应不同
更广泛地说,用于筛选转录因子基因和基因网络的相同方法可以用于改进制造任何细胞类型的方法,这对于再生医学和细胞治疗来说可能是变革性的
例如,格斯巴赫的团队报告了一种方法,利用基于CRISPR的基因激活将人类干细胞转化为肌肉祖细胞,这些细胞可以在今年早些时候再生受损的骨骼肌组织
格斯巴赫说:“这项工作的关键是开发方法,利用基于CRISPR的DNA靶向的能力和可扩展性,将任何功能编程到任何细胞类型中。”
“通过利用已经编码在我们基因组中的基因网络,我们对细胞生物学的控制得到了显著改善
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