马克斯·普朗克学会 CRISPR干扰使用一种失活的Cas9蛋白(d Cas9)和一种单一的导向RNA (sgRNA)，能够特异性敲除细菌代谢网络中的酶。
深度测序可以并行跟踪7177 CRISPRi的生长，并告知每个CRISPRi菌株的鲁棒性
学分:马克斯·普朗克陆地微生物研究所/链接 代谢稳健性，即代谢系统缓冲环境变化的能力，对微生物学家来说并不总是一个受欢迎的特征:它干扰代谢工程或阻止抗生素杀死细菌
因此，重要的是要理解使代谢强健的机制
一个大规模并行的CRISPRi屏幕显示
大肠杆菌的新陈代谢对酶的敲除非常强健，多组学数据揭示了其背后的机制
在未来，研究人员希望应用这些知识来建立更好的新陈代谢模型，从而实现工业微生物的合理设计
在它们的自然栖息地，像大肠杆菌
大肠杆菌面临着营养成分的不断变化
但是在实验室条件下，它们也可以成为真正的专家，例如在葡萄糖这样的单一碳源上生长
要做到这一点，他们的代谢网络必须从头开始合成所有的细胞构件
这项任务要求代谢网络中数百个酶催化的反应以正确的速度进行，并且没有反应意外地低于临界阈值
否则，网络中的一个瓶颈可能会导致广泛的后果，并最终阻止细胞的生长
为了理解E是如何
由Dr
马克斯·普朗克陆地微生物研究所的汉尼斯应用了CRISPR干涉技术
通过诱导大肠杆菌代谢网络中每种蛋白质的敲除
他们用7177个菌株创建了一个CRISPRi文库
在混合竞争分析中对文库进行深度测序，使研究人员能够在14小时内跟踪每种CRISPRi菌株的适合度
这个大规模并行CRISPR屏幕的结果有些令人惊讶
虽然只有七个基因的敲除——代谢网络中的关键点，如合成脱氧核苷酸的生物合成——会导致立即和强烈的适应性缺陷，但数百个其他敲除几乎没有影响
作为博士
汉尼斯·林克解释道:“我们的结果表明
大肠杆菌细胞具有很高的代谢稳定性
总的来说，坚固性使生物体能够在外部和内部干扰下生存，并且有不同的机制来调节它，例如反馈机制或冗余
在这种情况下，生物体总是处于权衡的境地:要么它们表达高浓度的酶，这是昂贵的；或者可能限制代谢能力的表达低的酶浓度
对我们这些研究人员来说，如果我们想用细菌进行新陈代谢来过量生产化学物质，细菌的强壮性并不总是一个受欢迎的特征，例如在生物技术应用的过程中
因此，理解E如何
大肠杆菌完成了这项任务
" 为了回答这个问题，研究小组测量了30个CRISPRi菌株的蛋白质组和代谢组
在一些菌株中，蛋白质组反应揭示了主动缓冲CRISPRi敲除的机制
例如，敲除甲硫氨酸途径中的同型半胱氨酸转甲基化酶(MetE)导致甲硫氨酸途径中所有其他酶的补偿性上调
换句话说，E
大肠杆菌细胞感觉到敲除导致甲硫氨酸生物合成的瓶颈，然后在甲硫氨酸途径周围产生非常精确的局部反应
其他30个CRISPRi菌株揭示了类似的缓冲机制，其特异性令人惊讶，但是否所有的代谢途径都配备了如此精确和局部的缓冲机制仍然是未知的
因此，林克实验室目前正在创新新的质谱方法，以探索完整的CRISPRi文库的完全代谢
这种综合方法为开发工业上有用的微生物创造了新的可能性
汉尼斯·林克指出:“在未来，我们希望利用这些数据来构建动态的、可预测的代谢模型
在当前的研究中，我们使用了一个非常小的动态模型，但是构建更大的模型仍然是一个巨大的挑战
这样的模型可以让我们设计出E
大肠杆菌细胞在某种信号下停止生长，然后将所有代谢资源集中在合成所需的化学物质上
这种增长与生产过剩的受控脱钩将在代谢工程领域开辟新天地，并在工业生物技术领域开辟新的应用
"
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