作者:本杰明·伯特纳，哈佛大学 研究人员将BOLORAMIS方法与单分子荧光原位杂交(smFISH)分析进行了比较，SMFISH是一种常见的核糖核酸定位研究标准，通过跟踪一种称为MALAT1的长非编码核糖核酸分子的位置。
然而，smFISH分析以相当扩散的方式检测MALAT1，BOLORAMIS将细胞中的单个MALAT1位点(左侧图像中的橙色)解析为小点，并显示细胞中的RNA在细胞质(顶部)和细胞核(底部)之间穿梭
左侧所有荧光图像中的细胞核都被染成蓝色，而右侧的图像显示了细胞整体结构MALAT1的位置
学分:哈佛大学威斯学院 人类细胞通常在任何给定时间将大约20000个基因的一半转录成核糖核酸分子
就像蛋白质一样，这些核糖核酸物种的功能不仅依赖于它们的丰度，还依赖于它们在每个细胞的三维空间中的精确定位
许多核糖核酸分子将基因信息从细胞核传递到分布在细胞质中的蛋白质合成机制，其他分子是该机制本身的组成部分，而仍有不同的分子调节基因及其表达，或具有有待发现的功能
重要的是，包括癌症和神经疾病在内的许多疾病都有核糖核酸丰度和分布发生变化的特征
为了能够分析细胞在3D空间中的完整核糖核酸集合，即转录组(空间转录组学)，怀斯研究所合成生物学家在核心教员乔治·丘奇博士的领导下
D
2014年报道了FISSEQ，这是一种有影响力的空间测序技术，能够同时读取成千上万个这种核糖核酸的序列，并可视化它们的三维坐标
然而，FISSEQ对如此大量的RNA目标进行定位测序的强大能力是有代价的:它对其中许多目标的检测效率和灵敏度相对较低，尤其是当它们的表达一开始就很低或在疾病中被下调时
现在，丘奇的团队开发了一种新的RNA检测方法，名为BOLORAMIS(简称“连接在扩增的RNA上的条形码寡核苷酸，用于多路复用和平行原位分析”)，克服了这个问题
BOLORAMIS能够设计和使用一种新型的DNA探针，该探针直接结合其RNA靶，并允许直接合成条形码d DNA扩增子，该扩增子可以通过荧光原位杂交(FISH)或原位测序进行可视化。
BOLORAMIS能够以比FISSEQ和其他方法更高的特异性和灵敏度分析不同种类的核糖核酸，在细胞和组织的环境中工作，并且可以高度复用
这项研究发表在《核酸研究》上
“借助博洛拉米系统，我们解决了空间转录组学领域面临的一些挑战
怀斯研究所合成生物学平台负责人、哈佛医学院(HMS)遗传学教授、哈佛和麻省理工学院健康科学与技术教授丘奇说:“这让我们在了解正常和病理过程中分子网络的行为、研究新的药物靶点以及在我们现在可以利用的组织的自然环境中开发临床诊断方面具有显著优势。”
“BOLORAMIS的优势在于其优化的探针在RNA上的足迹非常短，并且它消除了在‘逆转录’步骤中首先生成RNA分子的DNA复制品的需要，这可能产生不确定的结果并且是昂贵的，”第一作者之一、丘奇团队的研究生刘说
这张图片显示了编码GAPDH看家酶的基因在整个人类大脑器官中的定位
用GAPDH特异性探针进行的BOLORAMIS方法(左)显示了清晰的定位模式，而用非特异性对照探针则不能产生有意义的模式
学分:哈佛大学威斯学院 在FISSEQ中，所有的核糖核酸首先被固定在适当的位置，然后整个核糖核酸序列被复制到它的互补的脱氧核糖核酸序列中(反转录)，然后被循环并放大成更大的脱氧核糖核酸球
这些可以在专门的荧光显微镜下进行测序和可视化
“在BOLORAMIS中，通过绕过这一反转录步骤，直接扩增RNA信号，我们减少了非特异性和假荧光信号，”刘说
博洛尼亚探针像挂锁一样紧密结合，对一个RNA分子中仅有25个核苷酸的小序列具有高特异性，因此与其他靶向空间转录组学方法相比，阿木足迹更小，从而提高了分辨率
此外，探针包含条形码序列，该序列为每个核糖核酸目标物种分配唯一的分子邮政编码
当条形码挂锁探针与核糖核酸杂交时，它们被环化并在目标核糖核酸的位置扩增成一个微小的扩增子，而不需要逆转录步骤
扩增子随后可以进行原位测序，或者使用第二种类型的探针(称为荧光原位杂交(FISH)探针)以高灵敏度进行定位，该探针识别包含在单个扩增子中的多个条形码
该团队首先通过量化77个编码一系列转录因子的多核苷酸和77个在基因调控中具有其他功能的非编码多核苷酸的水平，探索了BOLORAMIS在人类诱导多能干细胞中的定量能力。
虽然博洛尼亚一直显示细胞中与“高干度”相关的核糖核酸的高和局部表达，但它揭示了促进分化的核糖核酸的低表达
在一个癌细胞系中，博洛尼亚能够定量追踪一种称为MALAT1的非编码RNA的位置和运动，该RNA在两个不同的亚细胞位置(细胞核和细胞质)之间穿梭
此外，研究人员证明，博洛尼亚能够在位于培养的人脑器官更复杂的组织环境中的细胞中以高灵敏度追踪普通的核糖核酸
“对我们来说，能够使用BOLORAMIS对许多核糖核酸进行多重分析是至关重要的，我们希望新的探针设计能够实现这一点，”第一作者苏康亚·蓬特哈姆贝克博士说
D
，丘奇团队的博士后研究员
实际上，由合著者安德鲁·鲍洛夫斯基开发的软件套件预测了任何基因序列的理想探针，然后可以合成为用于特定目的的综合文库
团队已经在GitHub服务器上提供了这个工具
“我们使用了神经元细胞和小胶质细胞的共培养系统，已知它们在许多正常和疾病过程中相互作用，并同时靶向96种不同的信使核糖核酸，”蓬特汉贝克说
“这使我们能够揭示特定细胞和核糖核酸之间的空间关系
" “在未来的研究中，博洛拉米斯在复杂的人类组织和人类特异性器官中的高功能性很可能使我们在破译与神经疾病相关的核糖核酸信号方面具有优势，”高级参谋科学家珍妮·谭博士补充说
D
他参与了这项研究，并整合了丘奇在威斯学院的一些研究活动
Wyss创始董事唐纳德·英格伯(Donald Ingber，M .)说:“用BOLORAMIS方法提供的更高的效率和准确性来评估整个细胞内核糖核酸分子的精确位置和水平，将大大提高我们理解细胞和组织如何影响正常生理和复杂疾病状态的能力，从而促进无数应用的新疗法和诊断的发展。”
D
，Ph
D
他也是英国皇家海军和波士顿儿童医院的犹大·福克曼血管生物学教授，以及哈佛大学约翰·阿的生物工程学教授
保尔森工程和应用科学学院
来源：由phyica.com整理转载自PH，转载请保留出处和链接！
