作者:Thamarasee Jeewandara,科学X网络,物理
(同organic)有机 无细胞蛋白质合成系统概述
合成系统由三部分组成:裂解物、能量溶液和质粒
裂解物是从大肠杆菌中收集的
通过细胞裂解和超速离心制备大肠杆菌细胞
能量溶液由核苷三磷酸、氨基酸、酶和辅因子组成
质粒通过将表达的目的基因插入表达盒来制备
将这三种成分混合并孵育以合成感兴趣的蛋白质
信用:微系统公司。纳米工程,doi: 10
1038/s 14378-019-0051-8 治疗性蛋白质是基于蛋白质的候选药物,在实验室进行生物工程,用于制药和临床应用
基于它们的药代动力学,可将候选物分成几组:(1)替换有缺陷或异常的蛋白质,(2)增加体内的现有途径,(3)在体内提供新的功能或活性,(4)干扰分子或生物体的活性,以及(5)递送包封的蛋白质或化合物,包括细胞毒性药物、放射性核素或效应蛋白
在最近发表在微系统和纳米工程杂志上的一项研究中
墨菲和他在弗吉尼亚理工大学化学和生物系统工程系的同事为蛋白质工程开发了一个高性价比的即时合成和纯化平台
他们构建了一个集成的微流体“芯片治疗学”(TOC)设备,用于在单一设置中实现无细胞、治疗性蛋白质合成和治疗性蛋白质纯化
在护理点环境中合成治疗性蛋白质的能力,可以在全球资源贫乏地区的配送过程中快速降低存储和运输成本,并有助于节约科学的概念
目前,大多数蛋白质是使用细胞培养系统生产的,例如用于大规模生产的重组大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞和植物细胞,之后它们从集中的铸造厂全球分布
然而,这些合成蛋白质的有限半衰期要求低温储存和运输设施,这对生活在偏远和资源匮乏地区的患者来说是一个挑战
在目前的工作中,墨菲等人
首先通过表达和纯化一种报告蛋白——绿色荧光蛋白,展示了该装置的工作原理
随后利用总有机碳生产抗菌肽天蚕素B——一种广泛用于控制生物膜疾病的抗菌肽
科学家们成功合成并纯化了天蚕素B,在6小时内产生了63纳克/升的浓度,纯度为92%,然后通过生长抑制试验证实了其抗菌特性
总有机碳技术为方便的临床治疗提供了一个新的即时蛋白质合成和纯化平台
A)合成模块的显微图像
b)合成步骤:开始合成和稳态合成
CFPS系统中产生的绿色荧光蛋白的蛋白质印迹和不同浓度质粒模板的蛋白质产量
用小鼠6 × His标记单克隆一级抗体和辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG二级抗体检测目标蛋白
列出的浓度是最终反应体积中的浓度
信用:微系统公司。纳米工程,doi: 10
1038/s 14378-019-0051-8 目前用于使用点蛋白质合成的最先进的设备包括冰箱大小的系统,该系统跨越两天的生产-纯化周期,每天生产800剂药物
然而,与这种系统相关联的资本成本在发展中国家是不可行的,在发展中国家,对用于分配的大规模治疗剂的快速生产的需求超过了用于长期储存的大规模治疗剂生产
在墨菲等人开发的目录系统中
科学家利用无细胞蛋白质合成(CFPS)过程完成了治疗性蛋白质的即时合成和纯化
在该系统中,重组蛋白在不使用活细胞的情况下表达,适用于现场生产,其中冻干的起始材料可以在宽温度范围内储存期间保持稳定
在研究中检测的蛋白质中,天蚕素B的最小抑制浓度为9
5纳克/升以发挥抗菌作用
使用微流控装置,科学家们将蛋白质合成和纯化结合起来,以临床相关剂量(63纳克/升)产生抗菌肽天蚕素B。
该装置中的连续流生产分三个开发阶段完成: 无细胞蛋白质合成(CFPS)反应器设计纯化反应器(磷)设计集成CFPS+磷系统设计 Murphy等人
使用基于软光刻的聚二甲基硅氧烷(PMDS)模塑来制造器件;使用微机械阀构建多层
在CFPS反应堆设备设计的第一阶段,科学家们制作了一个蛇形通道微流控芯片,类似于以前对芯片上蛋白质合成的研究
微流体装置包含连接到放置在显微镜加热台上的注射泵的入口,其中三个入口接收(1)细胞裂解物,(2) CFPS反应缓冲液和(3)进入具有一个出口的长蛇形通道(约130厘米)的脱氧核糖核酸模板
科学家们以0
15升/分,由注射泵驱动,停留时间为1
5小时
他们用阶段加热器(37摄氏度)加热反应器,并使用COMSOL Multiphysics软件对装置进行建模,以验证装置的机械性能,从而优化基于芯片扩散的混合和反应
为了验证该装置的工作原理,墨菲等人
使用多种脱氧核糖核酸模板合成了报告蛋白绿色荧光蛋白
该系统在恒定的反应时间内产生大量的蛋白质
微流体室中的蛋白质纯化
A)净化模块的显微图像
b)三种不同工作流程的纯化程序概述(包括珠装载、床层形成、蛋白质吸附、洗涤和洗脱)
工作流程1使用流动吸附和洗涤步骤
工作流程2使用流动吸附和振荡洗涤
工作流程3使用振荡吸附和洗涤
深蓝色表示关闭的阀门,透明表示打开的阀门
c)纯化芯片纯化的绿色荧光蛋白的SDS-PAGE
m(标记);D(耗尽):珠子吸收后的CFPS反应混合物;去除:去除净化缓冲液中的污染物;产品:洗脱缓冲液中纯化的绿色荧光蛋白
纯化步骤优化
通过考察4个条件进行优化
(1)镍-NTA珠体积为5或8l;(2) 0
在纯化和洗脱缓冲液中加入5%吐温-20
(3)不同的工作流程
(4)不同的振荡吸附时间
信用:微系统公司。纳米工程,doi: 10
1038/s 14378-019-0051-8 在第二阶段,墨菲等人
根据高效吸附和洗涤方案,设计了一种用于蛋白质纯化的微流体装置,正如之前同一研究团队所证明的那样
他们使用电磁阀控制单个微机械阀和相关的振荡压力脉冲来操作该装置,以在四个主要步骤中进行蛋白质纯化
在工作流程中,步骤是(1)珠装载,(2)蛋白质吸附,(3)洗涤和(4)洗脱
为了优化这个过程,科学家们将这个方法划分为三个不同的工作流程
Murphy等人
然后改变影响蛋白质纯化结果的条件,以获得高达98的产品纯度
5 %,收益率为54
6 %,优于其他方法
用于无细胞蛋白质合成和纯化的集成系统
集成CFPS +平台的显微照片
b .综合CFPS + P平台设置概述
该系统由计算机控制的电磁阀和注射泵组成,连接到放置在加热台上的微流体装置
信用:微系统公司。纳米工程,doi: 10
1038/s 14378-019-0051-8
在第三阶段,科学家开发了一个集成的微流体平台,用于自动化的无细胞蛋白质合成和纯化(CFPS+磷)
他们结合了连续流反应器和间歇式净化装置,尽管这两种工艺从一开始就互不兼容
为了达到足够的兼容性,他们在纯化之前,用一个储存芯片上连续产生的蛋白质的试管将两个过程连接起来
本研究中用于操作微流体系统的所有设备都可能适合公文包的大小,使其成为高度便携的治疗性蛋白质生产系统
总体而言,完全集成的CFPS+磷芯片包含五个主要步骤,包括引发、蛋白质合成、蛋白质吸附、洗涤和洗脱
在第六步中,科学家们安排珠刷新
Murphy等人
使用蛇形合成通道作为单独的合成模块,在合成了所需量的蛋白质后,他们关闭了纯化模块的设置,以启动后续的纯化过程
为了测试该装置的工作流程,科学家们使用了绿色荧光蛋白,并获得了98%的纯度
左:整合的无细胞蛋白质合成和纯化平台的概述和操作分为5个主要步骤:a)引发,b)蛋白质合成,c)蛋白质吸附,洗涤和洗脱,以及可选的第6步珠子刷新
信用:微系统公司。纳米工程,doi: 10
1038/s 14378-019-0051-8
右图:利用集成CFPS +磷微流控装置合成和纯化天蚕素B
a)经整合芯片合成纯化的天蚕素乙的三嗪-聚丙烯酰胺凝胶电泳
m(标记);d(耗尽):珠子吸收后的CFPS反应混合物;r(去除):去除净化缓冲液中的污染物;产品:洗脱缓冲液中纯化的腺苷酸
使用多个吸附循环优化天蚕素乙的回收
大肠杆菌的生长抑制试验
大肠杆菌一式三份,使用蛋白质产品(洗脱),在三个吸附/洗脱循环后,通过我们的装置与不同浓度的天蚕素B标准品(0-100纳克/微升,标为STD 0-100)进行比较
每30分钟测量一次OD600,持续18小时
使用浓度为27纳克/微升的60微升溶液进行洗脱
添加代表三次试验平均值的趋势线来引导眼睛
信用:微系统公司。纳米工程,doi: 10
1038/s 14378-019-0051-8
在使用绿色荧光蛋白优化CFPS+磷工作流程后,科学家使用相同的设置来优化合成天蚕素B的条件
通过在装置中遵循表达、纯化、电泳和染色的步骤
证实了天蚕素B的成功生产和纯化,回收的可溶性蛋白洗脱量为63纳克/升,纯度为92%
然后他们测试了天蚕素B相对于维生素E的生物活性
大肠杆菌抑制:通过抑制细菌生长来证明成功的抗生素活性
通过这种方式,使用微流体装置合成和纯化的治疗性蛋白质显示出对细菌生长的积极和有效的抑制
低成本的系统可以主动集成到低资源环境中,用于节约科学
Murphy等人
打算在未来基于正在进行的优化使系统完全自动化
他们设想将该装置应用于工程化一系列不同的治疗性蛋白质,以实现经济高效的护理点生产
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