作者:Thamarasee Jeewandara，Phys
（同organic）有机 重构流体壁的图案
观看完整电影，学分:科学进步，doi: 10
1126/sciadv
aav8002 生物学中日常使用的细胞培养板可以有效地转化为微流体装置，为生物学家将基于细胞的工作流程小型化开辟了道路
在最近的一份报告中
D
研究员克里斯蒂安·索伊图和牛津大学工程科学和病理学系的同事们
K
描述了一种在细胞周围创建微流体排列的简单方法
在这项研究中，当科学家将容器中不混溶的流体介质之间的界面用作建筑材料时，细胞已经在标准培养皿表面生长
他们根据需要，通过重塑活细胞周围的流体结构，将传统的细胞培养皿改造成复杂的微流体装置
Soitu将他的研究团队建立的新流体成形技术描述为“那些在选择住所时害怕承担责任的细胞的流体结构——它们可以很容易地被移除，新的细胞(具有不同的几何形状)建立在适当的位置
这项研究现在发表在《科学进展》杂志上 研究人员使用涉及细胞克隆的工作流程演示了该方法；选择性克隆培养皿中的特定克隆；药物治疗；和伤口愈合
这项研究工作展示了一种多功能的方法，结合生物友好的特点，以促进生物学家之间的微流体技术
基于微流体的方法已经在许多工作流程中流行起来，尽管由于各种原因，它们在主流生物学中的吸收仍然缓慢，这些原因包括: 细胞生长的材料不相容性封闭且不可接近的微流控架构重新定义了无法在实验过程中重新配置的几何形状，导致制造和操作成本工程师设计的工作流程与生物学家开发的现有技术不一致
过去，科学家创造了具有纳米级流体壁的三维结构，尽管它们的生物相容性仍有待评估
因此，在目前的工作中，Soitu等人
开发了一种在原始培养皿上制作隔离微流体室阵列的方法，以适应细胞生物学的主要工作流程
可能的例子包括细胞饲养和转移、克隆、冷冻保存、固定和免疫标记、细胞裂解和反转录聚合酶链反应和CRISPR-Cas9基因编辑
在此类工作流程的先前实验中，科学家在微流体制造后添加了细胞
在目前的工作中，研究人员在含有贴壁细胞的标准培养皿上创建了各种微流体装置，并对其进行了实时重新配置
他们分离和回收细胞克隆，以进行概念验证药物测试和伤口愈合分析，并引入新技术，在细胞生长和分裂的同时，在培养皿上创建和重新配置微流控电路，在主流生物学中有许多潜在应用
顶部:室结构
(一)原则
将杜尔贝科的改良鹰氏培养基(DMEM) + 10%胎牛血清(FBS)添加到原始培养皿中，移除大部分培养基以留下覆盖底部的薄膜，该薄膜覆盖有FC40
触针在底部移动以产生微流体排列
完成后，DMEM + 10%的光纤光栅的初始体积将被分成两部分，由固定在衬底上的FC40的连续液体壁分开
(二)不同的模式
(a)形成等间距的垂直和水平线条，形成一个阵列(32×32；1毫米间距)
接下来，打印机将60 nl的蓝色染料添加到选定的腔室中；外围的房间用蓝色染料染出蓝色方块，内部的房间用“OXFORD”这个词
放大图(右)显示了没有和有染料的单个腔室
(b)通过用手写笔形成两个正方形(一个比另一个稍大)，然后手动向两个正方形之间的空间添加染料，形成类似的图案；每一个字母都是通过形成其侧面并再次手工填充内部而制成的
放大显示字母“F”是一个连续的液体体
图片来源:牛津大学克里斯蒂安·索伊图
底部:重新配置微流体装置
图像显示电影中的帧
(1)印刷初始图案:圆(半径，1
5毫米)在三角形内(边，7毫米)在正方形内(边，9毫米)
(2至4)将不同的染料添加到每个隔室(1
5 μl红色染料，1
黄色染料5 μl，蓝色染料5μl)；染料被限制在FC40墙内
(5)在圆圈中加入更多黄色染料
(6)在加入3 μl黄色染料后，圆形钉扎线破裂，内容物溢出到三角形中
(7)添加24 μl后，三角形钉扎线破裂，内容物溢出到正方形中
(8)从正方形中取出60微升
(9)打印一个新的图案——三角形(边，4
5毫米)的圆(半径，3
3毫米)—在初始正方形中
(10至12)如前所述，将有色染料添加到三个不同的隔间中
图片来源:牛津大学克里斯蒂安·索伊图
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aav8002 新技术和概念验证实验 在随后的实验中，研究人员首先用组织培养基覆盖培养皿底部，并去除大部分培养基，形成覆盖聚苯乙烯基底的薄膜
他们用不混溶的氟碳化合物(FC40)覆盖薄膜，以防止蒸发，并作为防止外部污染物的屏障，以保持介质的无菌性
然后，研究人员使用特氟隆尖端接触培养皿底部，置换水相，形成感兴趣形状的微流体排列——在本例中，为正方形
利用这项技术，研究人员将开放式微流控平台的优势带到了标准细胞培养器皿中
Soitu等人
对水相进行整形，以创建一个网格，其中包含低体积的液体，正如该团队之前所展示的那样，并在选择性室中用选择性染料观察它们
例如，外围的小室接受蓝色染料(形成一个蓝色正方形)，内部的小室形成“OXFORD”这个词
" 创建用于分离细胞克隆的室
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aav8002 研究人员在正方形内的三角形内“打印”出一个圆，并使用三种染料的微升来分别观察这三种形状；FC40防止染料混合
结果显示了建立和破坏FC40壁的能力，以有效地将液体限制在任何期望的二维形状
在初步的概念证明结果之后，Soitu等人
生成室阵列以概括小鼠乳腺肿瘤细胞(NM18)的克隆，他们最初为其创建网格，随后添加细胞
研究人员首先让细胞在O2和CO2均可渗透的FC40壁的包围下自由生长，然后在用不同形状的流体壁包围它们之前，将单细胞培养成克隆
他们表明，只要菌落在随后的处理或回收过程中保持相互隔离，就可以很容易地在活细胞周围建立具有不同二维足迹的液体壁
以前的研究表明，在有限的、预先形成图案的表面上生长细胞需要在细胞粘附之前进行表面处理——这是目前技术中的一个显著的例外
在克隆挑选和药物测试中的应用 左:半自动化选择性克隆选择(HEK细胞)
打印机在不同阶段向腔室添加/从腔室移除微升
(一)方法
玻璃“参考板”上的位置用独特的标识符(即
e
，A1，A2 …，B1…)
将带有菌落(红色)的6厘米培养皿放在参考板上
在记录了菌落位置并将其输入脚本后，在选定的克隆体周围打印出液体壁(黑线)
从这些室中取出克隆体
(二)分离克隆
将HEK细胞以低密度(~1细胞/cm2)接种并生长(8天)成克隆，将培养皿放在参照平板上，并在选定的克隆周围建墙
显示了一个克隆的三个不同z轴视图
(一)标示牌，标示牌上有独特的标识
放大聚焦菌落(标识符失焦)
建造围墙后的殖民地
(三)克隆采摘
围绕一个活的殖民地建造的方形墙
打印机通过添加/回收1μl PBS来清洗细胞；然后加入1 μl胰蛋白酶
将培养皿保温(37℃；5分钟)以从表面分离细胞，并且打印机取回1 μl包含富含细胞的悬浮液(并将其转移到微量离心管)以离开现在空的室
将回收的细胞手工接种在12孔微量滴定板中，常规培养5天；细胞附着并生长
右:两种药物治疗与未治疗的细胞并行
围绕HEK细胞(300，000个细胞；6厘米皿)生长24小时
(一)嘌呤霉素(3 × 3格；2毫米× 2毫米室)
打印机向中央室添加1 μl培养基，向外周室添加1 μl培养基+嘌呤霉素(最终浓度，10 μg/ml)，如图所示
孵育后评估细胞活力(37；24小时),使用台盼蓝排除试验
外室中的细胞死亡(每个细胞超过60%)，而中心室中的细胞仍然存活(细胞死亡少于5%)
该试验已经重复了三次
(二)肿瘤坏死因子-α
印刷成对具有不同形状的腔室，一个围绕另一个
打印机添加了0
5微升培养基肿瘤坏死因子-α(最终浓度，10纳克/毫升)至一个或另一个体积(如漫画所示)
当细胞编码由肿瘤坏死因子-α启动的启动子控制的绿色荧光蛋白报告基因时，它们在暴露于细胞因子时发出绿色荧光
荧光图像显示只有处理体积中的细胞发出绿色荧光
体积对具有以下尺寸:(a)正方形(边，1
8毫米)英寸圆(半径，1
75毫米)；(b)三角形(边，1 mm)正方形(边，3
5毫米)；(c)正方形中的圆(半径，1 mm )(边，3
5毫米)
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aav8002 在下一步中，研究人员创建了一个参考板，他们在上面放置了一个含有感兴趣的活细胞集落的培养皿，通过在它们周围打印液体壁来将感兴趣的细胞克隆与其他细胞克隆分开
在隔离状态下，他们可以挑选菌落，回收细胞，然后按常规培养它们，使其按预期繁殖
因为流体壁可以有效地限制液体
通过添加嘌呤霉素来测试它们的效率，嘌呤霉素是一种杀死哺乳动物细胞的小分子翻译抑制剂
在药物筛选实验装置中，他们允许中心腔室单独接受生长培养基，而药物以高致死剂量输送到周围腔室，以显示当只有中心腔室中的细胞系存活时FC40分离的功效
在第二个例子中，Soitu等人
利用人类胚胎肾细胞系的特性，对其进行遗传修饰，以编码绿色荧光启动子基因
其在肿瘤坏死因子-α存在下开启，发出绿色荧光
液体壁形成了有效的药物暴露屏障，验证了该技术的药物筛选潜力
在伤口愈合中的应用 一种概念验证伤口愈合试验，使用一个在不同区域预涂有基质凝胶和纤维连接蛋白的培养皿
(一)卡通图解工作流程
一薄层介质覆盖有FC40
两个腔室(每个3毫米× 4毫米)并排印刷
室中的表面涂有基质凝胶或纤连蛋白(2微升；最终浓度为1μg/cm2；1小时)；插图显示了一个房间的图像
液体壁现在被破坏了，用3毫升的培养基清洗培养皿，除去未附着的涂层
(d)将HEK细胞(600，000个)置于培养皿中
24小时后，细胞形成单层，伤口(0
4毫米× 2毫米)是通过在表面上刮擦触针以去除其路径上的细胞而产生的
现在伤口的愈合是用显微镜监测的
(乙和丙)图像的伤口单层生长在基质凝胶或纤维连接蛋白
(a)和(b)就在受伤前后(FC40的一些液滴留在墙原来所在的地方)
24小时后，细胞生长使伤口宽度减小至& lt0
2 mm和& lt0
15毫米，分别含有基质凝胶和纤连蛋白
到48小时，伤口已经完全愈合
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aav8002 他们还通过使用一个以两种不同方式涂覆的培养皿来监测两种伤口愈合情况，从而完成了原理性伤口愈合试验
为此，研究人员使用了基质凝胶——肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质和纤维连接蛋白——一种促进伤口愈合的细胞外基质糖蛋白
他们加入了在培养皿中形成单层的HEK细胞，当细胞以略微不同的速度迁移到伤口中时，通过拖动特氟隆尖端穿过单层来制造“伤口”
虽然在这个工作流程中，Soitu等人
在电镀细胞之前对表面进行预涂覆，在细胞开始迁移到新形成的伤口中以促进愈合之后，他们还可以修改涂覆技术以增加其量
通过这种方式，克里斯蒂安·索伊图和他的同事开发了一个灵活的微流体平台，使细胞生物学的工作流程小型化
他们在目前的工作中扩展了该技术，在预镀的粘附细胞周围形成微流体装置，随后进行各种关于细胞克隆、药物筛选和伤口愈合的原理验证试验
该平台具有许多优点，并且可以替代传统模式的预先设计的微流体装置，作为灵活且可定制的替代方案
新的微流体装置具有成本效益，有助于节约科学，并且可以在实验过程中实时重新配置，以增加通用性
研究人员注意到该技术的局限性，包括二维受限排列和流体壁相对于固体壁的脆弱性
Soitu等人
希望优化并结合这些特点和优势，为主流生物学家探索微流体的力量提供一个新的平台
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