作者:Thamarasee Jeewandara，Phys
（同organic）有机 节选自延时电影《1小时内使用奇迹检测法检测微小核糖核酸》
学分:科学进步，doi: 10
1126/sciadv
aau9443 微小核糖核酸(miRNAs)是短的非编码调节核糖核酸，可以转录后抑制基因表达，因此越来越多地被用作疾病的生物标志物
检测微小核糖核酸可能是艰巨和昂贵的，因为它们需要扩增，标记和放射性探针
在最近发表在《科学进展》杂志上的一份报告中，阿伦·理查德·钱德拉塞卡兰和他在纽约州立大学奥尔巴尼分校核糖核酸研究所和生物科学系的同事报道了一种使用构象无反应的脱氧核糖核酸纳米开关的单步非酶微小核糖核酸检测方法
科学家们将这种检测方法命名为“奇迹”，简称为“微核糖核酸激活的工程开关条件循环”
该分析使用琼脂糖凝胶电泳读数证明了亚同源和单核苷酸特异性
在实验中，他们从纳米尺度的分化肌肉中提取的核糖核酸中检测到细胞微核糖核酸
科学家们提出了一种经济有效的实验装置，可以在几个小时的时间内检测微小核糖核酸，为定量聚合酶链反应(qPCR)和Northern印迹法量化调节遗传物质的现有方法提供了一种令人信服的替代方法。
微小核糖核酸可以通过影响体内细胞的增殖、分化和凋亡来调节正常生理发育和疾病过程中的许多生物过程
微小核糖核酸的表达可以在组织、细胞和体液中量化，作为细胞事件和疾病诊断的稳定生物标志物，突出了它们检测的重要性
然而，由于丰度低、体积小和序列相似，微小核糖核酸的检测具有挑战性
生物分子包含大约0
01%的总核糖核酸含量和每个细胞范围的单个核糖核酸拷贝可以有很大的不同
此外，一个家族中的微小核糖核酸可能因单个核苷酸而不同，而特定的微小核糖核酸可能在疾病和正常细胞功能期间受到调节
因此，检测微小核糖核酸的策略需要高度的特异性和从富含主要核糖核酸分子的样品中正确识别几个分子的能力
左:奇迹检测的概念和工作流程
奇迹分析的工作流程:将定制的DNA纳米开关与目标微小核糖核酸样品混合，孵育，并在琼脂糖凝胶上运行进行检测
(二)当与目标微小核糖核酸结合时，脱氧核糖核酸纳米开关经历了从线性“关闭”状态到环状“打开”状态的构象变化
插图:纳米开关由单链M13支架、骨架寡核苷酸和与靶微小核糖核酸互补的单链延伸(检测器)组成
电泳过程固有的嵌入染料提供了使纳米开关可视化的信号
这两种构象在标准琼脂糖凝胶中是可分辨的
右图:对DNA纳米开关构建过程的深入研究
线性化:线性单链M13支架的制备通过退火寡核苷酸来进行，以使限制性酶(在这种情况下为BtsCI)能够在双链位点切割
组装:DNA纳米开关组装是通过将10倍摩尔过量的主链寡核苷酸和检测链(特定于目标)混合到单链M13上，并以1℃/分钟的速度施加从90℃到25℃的冷却斜坡来进行的
纯化:为了去除过量的寡核苷酸，使用液相色谱法
检测:为了使用纳米开关，它们与含有微小核糖核酸靶的溶液混合，并在凝胶上运行，以解析开关状态，如插图所示
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aau9443 传统的微小核糖核酸检测方法包括Northern印迹、定量逆转录聚合酶链反应、下一代测序和基于微阵列的杂交，以分离微小核糖核酸信号和噪声
在指定的方法中，Northern印迹可以直接鉴定天然的微小核糖核酸，而其他方法依赖于额外的标记方法或逐步扩增，增加了检测的成本、复杂性和性能
例如，创新的脱氧核糖核酸纳米结构可用于微小核糖核酸的检测，各种研究小组以前曾将纳米结构与纳米粒子、杂交链式反应和过渡金属双歧杆菌纳米片相结合，以实现这一过程
在目前的工作中，钱德拉塞卡兰等人
开发了一种相对简单的基于脱氧核糖核酸的设备来解决复杂的生物医学挑战
在奇迹检测中，科学家们使用了一种由合理设计的脱氧核糖核酸纳米开关组成的“智能试剂”，用于简单且经济高效的天然微小核糖核酸检测，而无需使用实验室中的专门设备
脱氧核糖核酸纳米开关最初是作为单分子生物物理实验的工具而设计的，后来因其使用凝胶电泳检测和鉴定生物分子相互作用的能力而得到认可
同一研究团队先前的合作研究工作侧重于分子检测，以量化蛋白质水平和检测合成的DNA序列作为概念证明
目前的工作扩大了初步研究和概念，以产生用户现成的多重微小核糖核酸检测和量化
科学家们使用一个使用普通实验室用品搭建的实验装置，在短时间内分析了纳米尺度的细胞核糖核酸提取物
他们将脱氧核糖核酸纳米开关设计成一个线性双链体，在目标微小核糖核酸分子存在的情况下形成一个环
为了建造纳米开关，钱德拉塞卡兰等人
使用脱氧核糖核酸折纸方法，将互补的短寡核苷酸与单链脱氧核糖核酸支架杂交
他们设计了两条距离较远的“检测器”链，其突出端与目标微小核糖核酸的不同片段互补
当微小核糖核酸识别并结合到结构上时，开关从线性“关闭”状态重新配置到环状“打开”状态
他们使用标准琼脂糖凝胶电泳对这两种状态进行量化，以检测环状纳米开关产生的信号
该信号仅被感兴趣的单个微小核糖核酸放大，结果与荧光共振能量转移技术相比是有利的
奇迹试验的验证
具有专为let-7b设计的检测器的脱氧核糖核酸纳米开关的特异性
检测器和目标微小核糖核酸之间低至1nt的错配消除了信号
(二)检测限的测定
数控，负控制
非盟，任意单位
(三)低浓度目标检测的时间进程
(四)不同反应时间测定的动态范围
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为了验证这个概念，研究小组选择了let-7b靶微小核糖核酸，因为它的高度保守家族有十几个相关的微小核糖核酸，这些微小核糖核酸因一个或多个核苷酸而异
这些微小核糖核酸是合适的，因为它们在多种人类疾病的生物功能和失调中起着关键作用
为了消除纳米开关和目标之间的串扰和噪声——与完美匹配相比，这导致信号强度降低，科学家们合理地重新设计了纳米开关
为了达到完美的特异性，他们破坏了错配一侧的相互作用
研究结果显示了所开发的检测方法的高度特异性，为高信噪比下微小核糖核酸检测的关键挑战提供了答案
微小核糖核酸的低丰度也需要高灵敏度的检测，这是科学家通过优化方案实现的
然后，他们对另外两种不同的微小核糖核酸(miR-15 a和miR-206)进行了类似的实验，得到了亚同源到单同源的检测水平
例如，对于低浓度的目标样品(6 pM)，信号增加4小时，超过该时间段后几乎没有变化
分化成肌细胞的微小核糖核酸检测
示意图显示成肌细胞，当在转基因和分化第1和第4天生长时收获，加工以产生总的和小的核糖核酸部分
早期肌源性分化标记物，Myog和晚期肌源性分化标记物，MHC，通过免疫细胞化学(B)免疫印迹和(C)免疫细胞化学进行测定以确定分化
Myog和MHC在DM1和DM4中均上调
甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为对照
(四)钱德拉塞卡兰等
在含有50纳克小核糖核酸和500纳克总核糖核酸的分化样品中检测到miR-206
凝胶强度的定量显示在分化过程中有一个急剧的渐进的上调，在小核糖核酸和总核糖核酸样品中都是相似的
从DM4样品中，我们注意到小至(H) 200皮克的小核糖核酸和(I) 500皮克的总核糖核酸的检测
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微小核糖核酸通常也在细胞培养物、组织样本和体液中进行研究，并容易处理以收集微克级的总核糖核酸以及小核糖核酸的亚组分
对此，钱德拉塞卡兰等人
使用成肌细胞作为肌肉分化的替代模型系统，以miR-206为主要靶标
在细胞培养过程中，他们发现了分化骨骼肌中的微小核糖核酸，其中分子miR-206在分化后期显著上调
当科学家收获未分化和分化的肌肉细胞以提取小核糖核酸时，他们使用蛋白质印迹法确认细胞分化，并分别对早期和晚期分化标记物肌配基(Myog)和肌球蛋白重链(MHC)进行免疫细胞化学
由于单个微小核糖核酸占总核糖核酸质量的百万分之一，检测微小核糖核酸就像大海捞针一样具有挑战性
因此，为了验证生物检测的分析，钱德拉塞卡兰等人
从不太复杂的小核糖核酸亚组分开始
其中使用miR-206靶向纳米开关，科学家观察到未分化样品和分化1-4天的样品之间的小核糖核酸中miR-206表达的逐渐增加
由于多种基因还可以在不同的细胞或疾病阶段改变它们的表达，这种现象需要额外的检测能力
为了在实验装置中实现这一点，钱德拉塞卡兰等人
利用纳米开关的可编程性，开发了一个多路复用系统，能够检测来自同一样本的多个微小核糖核酸
他们将检测链放置在DNA支架的预期位置，当与目标微核糖核酸结合时，会产生不同大小的环
因此，纳米开关的环大小决定了凝胶的迁移，从而在凝胶上形成一个独特的条带，用于准确检测
在实验中，科学家选择了肌肉细胞中存在的四种微小核糖核酸；miR-206、miR-125b、miR-24和miR-133-3p以及阴性对照miRNA对秀丽隐杆线虫有特异性的miR-39
在50纳克的小核糖核酸范围内，科学家们检测到四种不同表达水平的微小核糖核酸，同时证实阴性对照没有检测到
多路复用策略允许科学家直接比较单个样本中的微小核糖核酸水平，而无需标记或扩增
总的来说，这项工作为扩大奇迹检测的通量提供了一个额外的步骤
该功能还可以扩展到每台交换机容纳更多的镜像
五通道多路复用设置
(一)多重化可以检测不同大小的不同微小核糖核酸
(二)多重纳米开关混合物在由所有五个目标微小核糖核酸组成的阳性对照中显示出五个强度相似的条带
在50纳克的DM4小核糖核酸中，以不同的表达水平检测到四种不同的微小核糖核酸
秀丽隐杆线虫-特异性微小核糖核酸)未被检测到
这样，钱德拉塞卡兰等人
从他们对合成的脱氧核糖核酸序列的初步概念验证检测中大大向前推进；用生物提取物建立、表征和优化现成的微小核糖核酸检测方法
演示的工作是第一个使用脱氧核糖核酸纳米开关从真正的生物样品中检测微小核糖核酸的例子
虽然与其他常用技术相比，微小核糖核酸分析的性能具有竞争力，但在目前的工作中看到的1个核苷酸的选择性很难用现有方法实现
奇迹的敏感性也优于北方印迹和微阵列
这种检测方法可以测量微小核糖核酸，而不需要扩增，使用更简单的方案，没有额外样品处理的额外误差
该方案简单地将纳米开关与凝胶电泳的样品液体混合，以在实验室中产生高质量的结果
研究工作有可能从生物样本转移到临床样本，以诊断和监测疾病
更重要的是，目前的工作符合节俭科学的更广泛的概念；一个有前途的高性价比科学愿景，已经为生物医学工程中的血液离心和水净化技术提供了低成本解决方案
Chandrasekaran等人
旨在通过打破现有的成本/性能关系，继续为科学领域的新兴趋势做出贡献，为使用混合读取智能试剂的简单微小核糖核酸检测方法提供广泛的途径
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