作者:Thamarasee Jeewandara，Science X Network，Phys
（同organic）有机 三维纳米内窥镜-原子力显微镜技术
(一)三维纳米内窥镜-原子力显微镜方法示意图，其中纳米探针在细胞内所需区域的不同位置重复引入
(二)用于三维纳米内窥镜-原子力显微镜测量的光纤制造纳米探针
(C和D)穿透细胞获得的典型F-z曲线，其中当纳米探针穿透外部细胞膜(C)时悬臂偏转的突然减小被描绘为峰值，在纳米探针穿透核膜(D)的情况下表现为另一个峰值
(G) 3D纳米内镜-包含在(E)红色方块中的整个HeLa细胞体积(40 × 40 × 6 μm3)的AFM细胞图，其中细胞膜、细胞核和细胞质区域可以在(H)显示的横截面中区分
(I) 3D纳米内窥镜检查-包含在(F)中红色方块中的HeLa细胞体积(10 × 10 × 6 μm3)的AFM图像，其中可以清楚地识别内部颗粒结构
信用:科学进展，10
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abj4990 原子力显微镜(AFM)为纳米级生物分子动力学的无标记成像提供了一种方法，以解决无法通过其他生物成像方法(包括荧光和扫描电子显微镜)解决的生物问题
由于这种成像方法只可能用于从细胞中提取的或在固体基底上重建的生物系统，所以现有的生物成像方法很大程度上仍然无法获得活细胞内的纳米动力学
在现在科学进展发表的一份新报告中，马科斯·佩内多和日本金泽大学纳米生命科学和生物技术研究小组通过使用纳米内窥镜-原子力显微镜克服了生物成像的限制
在此过程中，他们将针状探针插入活细胞中，呈现肌动蛋白纤维、三维(3D)图谱和膜内支架的2D纳米动力学，而细胞活力没有检测到变化
与早期的原子力显微镜方法不同，纳米探针直接接触目标细胞内成分，并探索原子力显微镜的功能，包括高分辨率成像、纳米机械制图和分子识别，以扩大活细胞内结构的可观察范围
生物成像细胞内动力学 细胞内成分的分子尺度动力学为细胞功能和疾病的基本机制提供了洞察力
然而，用于活细胞中这种纳米动力学的直接成像方法是具有挑战性的
例如，虽然电子显微镜对真空中冷冻细胞的纳米结构成像是有用的，但是除了作为固定构象的静态快照之外，它们不能对生理环境下活细胞的纳米动力学成像
类似地，虽然通过荧光标记的荧光显微术提供了一种可视化活细胞中蛋白质和细胞器动态的强大方法，但是它们受到无法在纳米尺度上有效成像的限制
因此，存在对液体环境中无标记细胞内成像方法的强烈需求
原子力显微镜(AFM)是一个潜在的候选角色，具有在亚纳米尺度成像的能力，能够在没有标记的情况下可视化脂质、蛋白质和脱氧核糖核酸的纳米动力学
然而，由于从细胞中提取或在体外固体基质上重建，这样的图像不能代表生物系统
因此，在这项工作中，佩内多等人
提出了一种基于原子力显微镜的成像方法，称为纳米内窥镜-原子力显微镜，用于观察活细胞内部的纳米动力学，而无需标记或分离它们
三维纳米内镜-原子力显微镜测量的细胞活力
(A)在用于细胞活力测试的HeLa细胞培养物中进行的不同测量区域，包括细胞核和细胞外围区域:(1) 2 × 2 × 7 μm3，(2) 2 × 2 × 10 μm3，(3) 40 × 40 × 8 μm3，和(4) 2 × 2 × 7 μm3，用红色方块突出显示；两个细胞用作对照，C1和C2
(B)四个成像细胞(1至4)和用作对照的两个细胞(C1和C2)随时间的细胞活力比，显示所有细胞(成像和对照)具有相似的平坦细胞活力强度比，并证实细胞没有被严重损伤
(丙)对应于(乙)中(一)的210分钟后荧光图像的例子，其中强绿色表示活细胞预期的正常酯酶活性
为了检查分析的有效性，在260分钟后向培养基中加入H2O2以杀死细胞，导致所有细胞的细胞存活率降低，这清楚地表明细胞正在死亡
(D)对应于(B)中时间(ii)的荧光快照，其中在所有细胞中清晰可见损伤的迹象，其中大多数细胞已经遭受收缩或凋亡
信用:科学进展，10
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abj4990 纳米内窥镜-原子力显微镜实验 在实验过程中，就像内窥镜摄像头一样，研究人员将一个长针状纳米探针插入活细胞中，进行2D和三维原子力显微镜成像
该团队展示了纳米内窥镜-原子力显微镜如何为纳米尺度的无标记细胞内活细胞成像提供独特的优势
该方法为观察生物系统中迄今尚未探索的现象提供了一条强有力的途径
Penedo等人
通过力-距离曲线测量，在细胞内所需区域的不同位置重复引入纳米探针
为了对整个细胞成像，纳米探针必须足够长以完全穿透细胞，直到它到达基底，并且直径低于200 nm以最小化细胞损伤，同时促进膜穿透
该团队使用商用硅四面体尖端作为纳米探针，他们使用聚焦离子束研磨至优选尺寸
该团队接下来在一个HeLa细胞的不同区域内使用纳米探针
在实验过程中，他们获得了一个完整细胞的三维纳米内窥镜-原子力显微镜图像，并从细胞的其余部分中识别出了HeLa细胞的细胞核
进一步的测量也显示了内部的颗粒结构
为了在渗透过程中最小化细胞损伤，Penedo等人
尽可能减小穿透力和压痕长度
他们还进行了细胞存活实验，以证实当使用直径小于200纳米的纳米探针时，3D纳米内窥镜-原子力显微镜不会导致严重的细胞损伤
使用三维纳米内窥镜-原子力显微镜，他们促进了活细胞内部细胞骨架的成像，以观察无支撑纤维的三维组织
该团队还成功地融合了三维纳米内窥镜——原子力显微镜和共聚焦显微镜的细胞内图像
共焦成像和三维纳米内窥镜的结合——原子力显微镜
(一)共聚焦荧光图像，其中染色的肌动蛋白丝可见
(二)在(一)中红方所示区域获得的放大图像
(C和D) 3D纳米内窥镜-在(B)中红色方块突出显示的区域获得的细胞骨架肌动蛋白纤维的AFM图，其中不同肌动蛋白丝(红色箭头)和上下细胞膜的Z垂直位置被同时解析
(B)中红色方块所示的半透明图像对应于(C)和(D)中所示的三维地图的2D投影
信用:科学进展，10
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abj4990 2D纳米内窥镜-原子力显微镜 将长纳米探针多次插入细胞同时保持细胞活力的能力意味着将探针的顶端定位在活细胞上以进行局部2D/三维原子力显微镜测量而没有实质性损伤的可能性
纳米探针可以插入细胞内，通过调幅模式原子力显微镜测量细胞膜的细胞质侧
纳米探针必须足够长以完全穿透细胞并到达其底部，同时足够薄以减少细胞损伤
为了在实践中做到这一点，佩内多等人
使用电子束沉积开发了由无定形碳制成的纳米探针，并测量了振幅与距离的关系，以确定电池的完整性
他们使用成纤维细胞进行了2D纳米内窥镜-原子力显微镜实验，以说明内部细胞膜的网状结构，并观察细胞结构以研究细胞结构的内部动力学
这项工作强调了使用2D纳米内窥镜-原子力显微镜研究生理环境下活细胞内部结构的纳米动力学的可能性
2D纳米内窥镜-原子力显微镜技术
(一)2D纳米内窥镜-原子力显微镜方法的图示，其中纳米探针插入细胞内部，通过调幅模式原子力显微镜测量细胞膜的细胞质侧
(二)在2D纳米内窥镜-原子力显微镜中使用的电子探针制造的纳米探针的例子，其中针的长度应该足够长以完全穿透细胞并到达其底部，并且足够薄以减少细胞损伤
(C)记录力(顶部)和振幅(底部)与距离的关系曲线，以精确定位上和下细胞膜:当纳米探针远离时，垂直力为零，一旦纳米探针接触上细胞膜，垂直力就会增加；之后，它呈现对应于内部细胞质区域的平台，直到当纳米探针到达底部细胞膜时，曲线再次急剧增加
针尖-样品距离调节的振幅设定点必须足够低，以确保针尖敲击细胞底面
(六)连续的2D纳米内窥镜检查-在BALB/3T3成纤维细胞上进行的AFM 1微米× 1微米图像，该区域由(四)中描绘的红点突出显示，显示了形成其支架的细胞膜内表面的网状结构以及测量过程中的膜波动
(G)在(F)中显示的图像的缩放区域，绘制点A和点B (E)之间的截面，其中由25 nm分隔开的两个突起在图像中被清晰地分辨
信用:科学进展，10
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abj4990 观点 通过这种方式，马科斯·佩内多和他的同事展示了纳米内窥镜-原子力显微镜在测量细胞膜细胞质内表面和相关结构方面的应用，以了解活细胞中肌动蛋白丝在其自然细胞内环境中的三维排列
该团队试图通过在实验中使用超薄针状纳米探针来最小化细胞损伤
除了2D投影和现有的荧光方法(如共焦或超分辨率显微术)之外，所提出的原子力显微镜方法产生了内部细胞结构的三维图
该方法将揭示体内细胞机制的作用，同时暴露生理分子马达
该方法也将为研究在细胞功能中发挥重要作用的细胞内纳米力学开辟新的可能性
该团队可以使用该方法来测量细胞核的硬度、粘附和耗散特性，以提取适合细胞生物学和医学交叉领域的生物信息
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