作者盖奇·泰勒，杰里米·拉姆齐，橡树岭国家实验室 SARS-CoV-2主要蛋白酶的三维结构
分子二聚体复合物由单个单体(绿色)结合到另一个单体(粉色)组成，其中药物抑制剂将结合到催化位点空腔以防止病毒复制
荣誉:ORNL/安德烈·科瓦列夫斯基，吉尔·海曼 随着新型冠状病毒的继续传播，研究人员正在寻找新的方法来阻止它
但是对两位科学家来说，展望未来意味着从过去汲取灵感
2020年1月，美国能源部橡树岭国家实验室(ORNL)的研究人员安德烈·科瓦列夫斯基(Andrey Kovalevsky)和丹尼尔·科内尔(Daniel Kneller)正准备用中子来研究一种特定的艾滋病毒蛋白酶(一种允许病毒在人体内复制的蛋白质酶)和一种被称为艾滋病毒蛋白酶抑制剂的抗逆转录病毒药物之间的关系
某些类型的艾滋病毒对这些药物产生耐药性
研究人员的目标是更好地了解蛋白酶变异是如何工作的，以帮助开发尖端治疗方法，甚至战胜最强的艾滋病毒耐药菌株
当研究小组开始工作时，他们几乎不知道，巧合的是，他们对艾滋病毒的研究将很快使他们走上一条应对新冠肺炎的新道路，这种流行病现在已经控制了整个世界
事实证明，使艾滋病毒能够繁殖的蛋白酶活性——科瓦列夫斯基的团队正在准备用中子进行研究的机制——与导致新冠肺炎病的病毒非典冠状病毒-2采用的复制机制相同
现在，研究小组已经转移了他们打算用来研究艾滋病的实验方法的焦点，以对抗新的全球威胁
艾滋病毒研究转向新型冠状病毒 科瓦列夫斯基已经研究艾滋病毒15年了
作为一名中子晶体学家，他通过用中子轰击生物物质的小结晶样品来研究它们
中子散射技术在揭示样品的原子结构和原子行为方面非常有效
根据不同的目标，收集到的见解可以为如何改善甚至抑制生物材料的某些特性提供指导
中子是研究生物结构和行为的理想工具，因为它们对氢等轻元素非常敏感，并且能够探测这些物质而不损坏它们
2019年，科瓦列夫斯基开始以一种前所未有的方式研究艾滋病毒
使用非弹性中子散射将使他能够收集关于艾滋病毒蛋白酶的动力学或运动的数据，这将增加他多年来收集的中子衍射数据
同时拥有结构和行为(或动态)信息将提供病毒如何工作的更完整的图像，进而可能导致治疗的新进展
在ORNL散裂中子源(SNS)——一种根据原子振动揭示原子运动的中子散射仪器——使用视觉光谱仪后，科瓦列夫斯基意识到他需要帮助来分析数据
“丹尼尔带来了病毒蛋白酶研究方面的专业知识，”科瓦列夫斯基在招聘科内尔时解释道
“他知道如何在实验室中处理蛋白质
他了解蛋白质生产、纯化、结晶、结晶数据收集和分析方面的所有实验室技术，以获得对药物设计的见解
" 科瓦列夫斯基说，经过广泛的搜索，丹尼尔花了大约8个月才被录用
2020年1月，专门用结晶学研究艾滋病毒蛋白酶的Kneller加入了科瓦列夫斯基的团队，帮助进行艾滋病毒蛋白酶的实验和计算工作
但是，就在团队准备投入工作的时候，新冠肺炎已经走向全球，研究遭遇了一个艰难的停顿
博士后研究员丹尼尔·科内尔正在利用ORNL结构和分子生物学中心合成与新冠肺炎相关的结晶蛋白质，并为散裂中子源和高通量同位素反应堆的中子散射研究做准备
信用:ORNL/卡洛斯·琼斯 改变策略，获得早期结果 今年3月，ORNL中子科学公司的工作人员制定了一项研究新冠肺炎关键部件的计划，组建了研究小组，并重新安排了ORNL的两个中子散射设施(SNS和高通量同位素反应堆(HFIR))的重要仪器的运行时间表
科瓦列夫斯基和科内尔已经奠定了研究蛋白酶的基础，他们很快就从艾滋病毒转向了新型冠状病毒
具体来说，他们目前的研究重点是导致新冠肺炎病的非典病毒的主要蛋白酶
“SARS-CoV-2蛋白酶是一种切割蛋白质的酶，使病毒能够繁殖
科瓦列夫斯基说:“了解蛋白酶是如何组装的，它是如何发挥作用的，这是找到有效的药物抑制剂来阻断病毒复制机制的关键的第一步。”
“与艾滋病毒蛋白酶相似，非典病毒的主要蛋白酶是目前设计特定抑制剂最有吸引力的药物靶点之一
" 与艾滋病毒工作的最初计划一样，该团队正准备使用SNS和HFIR的仪器，以获得蛋白酶中的原子是如何排列的基本见解
使用曼迪和想象仪器，研究人员将能够通过使用中子跟踪结晶蛋白质样品中的氢原子来拼凑蛋白酶的原子结构
但是首先，他们必须获得高质量的晶体，这些晶体要大到足以进行中子实验
这是团队早期取得重大进展的地方
晶体质量首先取决于它们衍射或散射x光的程度
典型地，这个过程是在同步加速器设备中进行的，在那里晶体可能被冷冻到大约100摄氏度(或大约-280华氏度)
该团队利用位于国家科学院的蛋白质结晶和表征实验室来培养SARS-CoV-2蛋白酶晶体，这需要大约一周到十天的时间
为了分析晶体的质量，他们使用了当地的x光机，里加库高通量家庭实验室，它提供了几个关键的发现
首先，x光实验证实这些晶体质量很高，而且用来生长它们的方法可能会产生更大的适合中子实验的晶体
第二，拥有一台本地机器可以让他们在室温(华氏70度左右)下收集x光测量结果
室温测量使他们能够观察蛋白酶结构的可塑性或灵活性，提供了关于该结构在接近病毒生理环境的条件下如何表现的可辨别信息
这些数据不可能用冷冻样本获得
“这是我们努力进行中子衍射的一个重要里程碑
对本地x光机的投资回报颇丰
“在一个例子中，我们在周一种植晶体，并在周二收集数据
否则，为了获得这些信息，你必须将你的晶体送到同步加速器，这可能需要几天到几周的时间
" “现在，因为大流行，你不能去同步加速器，”科瓦列夫斯基补充说
“要在室温下分析晶体，你必须在场
" “我们从室温结构中学到的信息能够立即影响研究人员使用的计算方向
我们发现室温下接近生理的结构和同步加速器的冷冻结构之间存在一些差异，这对计算工作可能很重要，比如ORNL超级计算机峰会上正在进行的小分子对接研究，”科内尔说
在ORNL蛋白质结晶和表征实验室中生长的非典型肺炎-冠状病毒-2蛋白酶晶体的显微镜照片
一旦晶体达到一定的尺寸和形状，它们将被用于中子散射实验，以确定SARS-CoV-2主要蛋白酶的结构和行为
信用:ORNL/丹尼尔·内勒 “到目前为止，我们对新冠肺炎的早期研究非常成功
我们已经提交了一份关于我们的结构发现的手稿供出版，在这份手稿中，我们基本上进行了两个月的研究，通常可能需要一年的时间
" Leighton Coates是SNS MaNDi衍射仪的仪器科学家，也是研究SARS-CoV-2蛋白酶的晶体学团队的成员，他帮助Kovalevsky和Kneller进行蛋白质晶体的数据和结构分析。
未来几个月产生的数据将与其他国家实验室、大学和更广泛的科学界共享，以建立更准确的计算模拟模型，用于识别潜在的候选药物来阻止病毒
“科学界对COVID-19大流行做出了迅速反应
科瓦列夫斯基说:“我们很幸运能够做出自己的贡献，利用多年的艾滋病毒研究经验，更好地了解诺埃尔冠状病毒是如何复制的，以及我们如何通过抑制其基本蛋白酶来对抗它。”
研究艾滋病毒耐药性 在大流行将他们的注意力和努力转向研究SARS-CoV-2之前，科瓦列夫斯基和科内尔有一个明确的计划来打击艾滋病毒
全世界有3900万人感染了艾滋病毒
为这些人提供更好的治疗选择不仅能提高他们的生活质量，还能防止这种疾病的进一步传播
艾滋病毒蛋白酶的工作原理是将无害或无功能的蛋白质链切割成更小的蛋白质，将它们转化为功能性病毒蛋白质，使病毒能够组装并继续感染健康的人类细胞
一般来说，艾滋病毒蛋白酶抑制剂在阻断艾滋病毒复制过程中的蛋白酶方面相当有效，但一些蛋白酶变体已经发展出抵抗药物抑制剂的能力
“如果我们能更多地了解使艾滋病毒蛋白酶变异体产生耐药性的分子机制，我们就能设计出更好的药物来战胜它的防御，”科内尔说
具体来说，Kneller和Kovalevsky希望探索PRS-17，这是一种独特的艾滋病毒蛋白酶变体，其被目前最有效的临床艾滋病毒蛋白酶抑制剂抑制的可能性是其他非抗性变体的10，000倍
科瓦列夫斯基解释说，虽然自20世纪80年代艾滋病毒大流行开始以来，艾滋病毒治疗项目取得了很大进展，但像PRS-17这样的变异体，由于长期治疗，可能会损害多年的药物创新和进展，导致抗病毒治疗失败
“耐药性现在是艾滋病患者面临的最大问题
通过适当的治疗，患者可以在体内检测不到艾滋病毒的情况下，过上幸福长寿的生活
他们不会发展成艾滋病，也不会把艾滋病毒传播给他人
但是PRS-17和其他耐药艾滋病毒蛋白酶变异体使医生很难在他们的患者中对抗艾滋病毒，”科瓦列夫斯基说
研究人员说，很难准确理解PRS-17是如何中和艾滋病毒蛋白酶抑制剂的功效的
病毒的组成蛋白是复杂的系统，PRS-17能够利用几种不同的机制来保护自己免受抗逆转录病毒药物的攻击
“弄清楚PRS-17如何抵抗艾滋病毒蛋白酶抑制剂是一个挑战，但我们绝对必须克服这个挑战
“PRS-17是一种临床分离物，这意味着它来自一个正在努力对抗这种疾病的实际患者，”科内尔解释说
“更多地了解它可以挽救许多病人的生命，因为我们利用PRS-17上的中子获得的知识可以转移到其他类似的极其耐药的蛋白酶变体上
" 一种与艾滋病毒蛋白酶抑制剂相互作用的耐药型艾滋病毒蛋白酶
Kneller和Kovalevsky希望他们用来了解更多艾滋病知识的同样技术也能帮助研究员对抗新冠肺炎
信用:ORNL/吉尔·海曼 该小组打算绘制一张PRS-17蛋白酶的图谱，以更好地理解其耐药性背后的分子机制
这包括在社交网络上使用曼迪和视觉仪器，在HFIR使用想象仪器
“这和我们现在在新冠肺炎尝试的方法非常相似，”科瓦列夫斯基说
Kneller和Kovalevsky与MaNDi和IMAGINE一起计划探测PRS-17蛋白酶的结晶样品，以生成其静态原子结构的详细数据
使用视觉技术将使他们能够探测PRS-17蛋白酶的粉末样品，通过测量分子振动来洞察其动态特性
中子特别适合于研究病毒的成分，如艾滋病毒(或SARS-CoV-2)，因为它们对氢敏感，氢是所有蛋白质的重要成分
利用中子结晶学，研究小组可以精确定位PRS-17蛋白酶中的每个氢原子，让他们对蛋白质的功能以及与蛋白酶抑制剂的相互作用有了前所未有的了解
“在MaNDi和IMAGINE使用中子结晶学来定位PRS-17蛋白酶晶体中的氢原子，将使我们能够建立其静态结构的全面轮廓，”科内尔说
“有了VISION，我们还可以跟踪氢原子，但我们将使用PRS-17蛋白酶的粉末样本，这些样本已经过再水合，以模拟艾滋病毒粒子的拥挤条件
这将使我们能够看到它的动态特性，并更多地了解它在病毒粒子中工作时可能如何运动
" Kneller解释说，获得关于PRS-17静态和动态特性的信息对于全面理解这种病毒对抗逆转录病毒药物的耐药性非常重要
“如果我每天午夜只追踪你的位置一次，我会认为你所有的时间都在家里
但实际上，你一整天都在四处走动
这就是为什么收集样品的静态和动态测量值非常重要
它让我们对蛋白酶的行为有了更全面的了解
“如果没有中子结晶学，每当研究人员试图理解蛋白质如何工作时，他们必须对蛋白质中氢原子的位置做出有根据的猜测，”科内尔补充道
“安德烈以前做过的这些类型的实验实际上已经能够证实这些氢原子在非抗性HI-V蛋白酶变异体中的位置，但在极度耐药的蛋白酶变异体中却没有
这意味着我们将能够产生关于这种蛋白酶的真正独特和新颖的数据
" Kneller和Kovalevsky希望有一天通过他们的实验产生数据，这些数据将成为研究人员对抗艾滋病毒耐药菌株的宝贵资源
“这是团队的努力
化学家、生物学家和制药行业的专业人士都必须共同努力来对抗疾病
“我们共同努力，可以开发出针对耐药艾滋病毒株的有效治疗方法
" 研究得到了美国能源部科学办公室通过国家虚拟生物技术实验室的支持，这是一个由美国能源部国家实验室组成的财团，重点是应对新冠肺炎，资金由冠状病毒关爱法案提供
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