作者:Phys Thamarasee Jeewandara
（同organic）有机 微尺度质谱代谢生物传感为筛选酶提供了一种通用策略
酶变体被设计并转化到酵母中(设计)，然后在酵母中合成，在那里它们消耗中心代谢的分子来产生产物(构建)
使用印刷的微液滴微流体，将它们分配到微微升的孔阵列中，并进行MALDI-MS成像以定量细胞代谢物(测试)
UMAP根据代谢组学图谱对细胞进行聚类，其中每个聚类指示不同的酶表型
从平板中提取所需的突变体，测序，并在大量培养中确认
信用:自然通讯，doi: 10
1038/s 1467-021-27185-9 酶维持着一系列的蛋白质序列和多样的结构形式，其活性远远超过最好的化学催化剂
然而，由于技术上的不足，用新的和改进的特性设计它们的研究是有限的
在《自然通讯》上发表的一份新报告中，徐和美国加州大学、密歇根大学和德克萨斯大学的生物工程、化学和分子生物学研究小组
S
描述了一种可扩展的方法来表征酶活性，该方法使用宿主细胞的代谢作为生物传感器来理解产物的形成
该团队随后通过质谱测量了不同产品的代谢途径，结果为他们提供了一条通用的途径来感知产品的形成，发现意想不到的结果，并绘制诱变的效果图
代谢工程:在实验室设计酶 酶工程是基于一个迭代循环，在这个循环中，基因变体的文库可以被设计并合成为蛋白质，以测试感兴趣的活性
尽管研究工作已经取得了成功，但大多数测试仍然处于瓶颈状态
研究工作的主要策略是基于孔板筛选来直接测量酶的产物
然而，这种方法在可伸缩性方面是有限的，因为它每个周期只能测试数百个变体
可供选择的方法包括流式细胞术和微滴微流体技术，但它们受到无法直接检测产物形成的限制
为了通过筛选增强工程酶的能力，一种新的方法是合适的，其中孔板的通用性可以与微流体的可扩展性相结合
在这项研究中，徐等人
描述了一种将微流体的可扩展性与质谱的通用性相结合的筛选方法
3型PKS变体文库概述
(a)非洲菊G2PS1 (PDB ID: 1EE0)的晶体结构，显示为诱变选择的四个残基的位置和残基突变体的身份
除T199以外的所有残基直接形成活性位点空腔
第三类聚酮化合物合酶活性预期的最小缩合/环化产物:来自一种乙酰辅酶a和两种丙二酰辅酶a的三乙酸内酯(TAL，G2PS1的天然产物)和来自一种乙酰辅酶a和三种丙二酰辅酶a的6-丙酮基-4-羟基-2-吡喃酮
更高级的聚酮化合物(未示出)可能来自丙二酰辅酶a的额外缩合
信用:自然通讯，doi: 10
1038/s 1467-021-27185-9 代谢工程:作用机制 在这种方法中，研究小组使用宿主的背景代谢作为生物传感器来评估嵌入其中的酶的活性，并使用微尺度质谱技术来表征代谢变化
这种酶催化中枢代谢的分子，扰乱或扰乱宿主的代谢谱，产生信号
徐等
然后测量这个信号，即使酶的产物没有被直接测量
这种方法提供了一种通用的方法来绘制突变酶的催化图，以了解可能产生的产物范围，然后记录具有所需活性或特征的变体序列
工作期间，徐等人
将基质辅助激光解吸电离(MALDI)-质谱用于单细胞代谢组学，也用于鉴定微生物菌落的酶产物
该团队随后将该方法与印刷微流体技术(PDM)相结合，从非洲菊(Gerbera hybrida)的文库中制备、印刷和筛选所有突变体，非洲菊是植物特异性聚酮合成酶
该酶负责通过起始乙酰辅酶a单元与两个丙二酰辅酶a分子的缩合来生物合成三乙酸内酯
研究人员还利用TAL作为平台前体来合成来自化石燃料的高价值化学物质，在这种化学物质中，这种酶活性位点的任何突变都会改变产品的动力学和光谱
与单个细胞相比，研究期间的培养扩增产生了额外的物质，通过准确的代谢数据提供了信号增强
绘制酶变体文库的催化活性图 通过代谢生物传感定位g2ps1突变催化
(a)单变量质谱载玻片(75毫米× 25毫米)概述，包含10，000口井，分成100口井的100个区块(放大蓝框)，比例尺1毫米
每个圆形孔都配有电极，用于收集印刷液滴(红色方框)，并具有圆形轮廓，可将干燥的代谢物集中到中央(绿色)
(b)质谱生成基底的空间图像，其中每个像素包含完整的m/z光谱
(c)使用UMAP提取井谱并将其分为四组
感兴趣的突变体被回收、测序，并作为黑点覆盖在簇上
插图显示了基于已知打印位置的参考应变
(d)m/z 127和189的热图显示，在上部和参考集群中，TAL产量高，而在下部集群中，AHP产量高
信用:自然通讯，doi: 10
1038/s 1467-021-27185-9 进行微量质谱分析，徐等
使用高密度平板，载玻片上蚀刻有10，000个孔，将材料集中到中心进行精确定量
他们用一个菌落装载所有的孔，在30分钟内完成PDM(印刷液滴微流体)
在打印过程中，该团队扫描了菌落，打印了9000个文库成员和1000个参考菌株
他们将平板干燥，并准备用于基质辅助激光解吸电离(MALDI)-质谱成像，通过质荷比提供所有可检测代谢物的数据
最重要的是，该方法固有地具有软电离，允许在分析后基于聚合酶链反应(PCR)回收酶基因
利用代谢生物传感检测酶变体的催化活性 研究人员使用这种方法提取宿主细胞中许多分子的信息，以便发现意想不到的酶活性
他们将细胞代谢组的变化绘制成统一的流形近似和投影(UMAP)，以获得高维数据，同时保留聚类信息
利用这些数据，徐等人
观察到对应于代谢物分布的四个簇
结果强调了明显扰乱细胞代谢的两种主要活动
为了描述这些活性与酶序列的关系，研究小组从每个聚类中选择并测序了突变体
结果，宿主细胞的代谢物图谱提供了一个生物传感器来检测包埋酶活性的变化
微量质谱筛选g2ps1突变体库以提高TAL或AHP产量
m/z 127与169的归一化m/z强度
数据点根据图1中UMAP分析识别的聚类进行着色
2
插图显示了参考应变样品
TAL和AHP的最高生产者被分离、排序并在批量分析中确认(黑色圆圈)
b .随着野生型的折叠变化，选定的大量培养物的TAL和AHP
n = 3个独立实验
条形图代表平均值，黑点代表样品的每次测量
信用:自然通讯，doi: 10
1038/s 1467-021-27185-9 观点 通过这种方式，林峰·徐和他的同事展示了代谢物传感如何允许他们检测产物的形成，而不直接检测产物，正如使用酶活性所解释的那样，这扰乱了宿主细胞的代谢物分布
考虑到这种扰动对于每种活性都是不同的，他们检测到了一个突变体库产生的多种活性
这种间接传感有利于酶工程
除了提供产品形成的通用读数，该团队还探索了细胞分析方法和基质辅助激光解吸电离(MALDI)-质谱方法，并将其应用于其他生物生产系统
这种方法可以应用于任何干扰宿主细胞代谢的工程方法，包括遗传途径和生物合成途径
来源：由phyica.com整理转载自PH，转载请保留出处和链接！
