作者:Thamarasee Jeewandara，Phys
（同organic）有机 河豚鱼TMEM206的功能和结构
(一)用于电生理学和单粒子低温电磁实验的通道结构示意图
“Thr”代表凝血酶切割位点
(乙和丙)典型的全细胞电流痕迹被细胞外酸碱度4激活
6适用于河豚鱼TMEM206 (B)和TMEM206EM (C)
在TMEM206敲除的人胚胎肾(HEK) 293T细胞中表达通道构建体
(四)河豚鱼的标准电流-酸碱度关系(每个数据点6至9个细胞)和河豚毒素(每个数据点5至6个细胞)
在室温下记录所有电流，并将其标准化至pH 4
+100毫伏时0电流
(五)河豚鱼对TMEM206和TMEM206EM的阴离子选择性
数据以平均值表示
s
，不显著；学生测试)
(六)河豚冷冻电磁密度
0 σ，由单个子单元着色
河豚的三聚体结构
学分:科学进步，doi: 10
1126/sciadv
abe5983 跨膜蛋白质206缩写为TMEM206，是进化上保守的氯离子通道，是普遍表达的、质子激活的、向外整流的阴离子电流的基础
在《科学进展》杂志上发表的一份新报告中，邓曾勤和美国圣路易斯华盛顿大学医学院的一个多学科研究小组
S
描述了河豚鱼TMEM206的冷冻电镜结构
该结构形成具有两个跨膜片段和一个大胞外结构域的三聚体通道
根据结果，邓等人
显示了如何从三个侧门进入细胞外区的充足前庭，其中中央孔包含多个结构
例如，靠近内螺旋细胞质区的一个保守的赖氨酸残基，可能形成了氯离子选择性过滤器
核心结构和组装类似于那些在氨基酸序列上无关的钠通道，因此传导阳离子而不是阴离子
与电生理学一起，他们为一类新的氯离子通道提供了关于离子传导和门控的见解，该类氯离子通道在结构上不同于先前描述的氯离子通道家族
氯离子通道 氯离子是动物体内丰富的阴离子，它们通过氯离子通道和转运蛋白穿过细胞膜，发挥多种细胞功能，包括细胞体积调节、细胞内酸化和肌肉兴奋性控制
这些离子在哺乳动物细胞中被广泛观察到，尽管氯离子背后的分子成分至今仍不清楚
两项使用全基因组RNA干扰筛选的独立研究已经确定TMEM206是潜在的阴离子通道。
TMEM206在脊椎动物中进化上是保守的
氯离子通道在氨基酸序列和三维结构上都是多样的
在这项工作中，邓等人
展示了河豚鱼TMEM206的冷冻电子显微镜结构，揭示了不同于以前已知的三聚体通道结构
科学家将电生理学与这项工作相结合，提供了进化上保守且广泛表达的氯离子通道的第一个结构和功能描述，以建立分子框架并理解氯离子传导和通道门控
子单元结构和通道组件
(一)单个亚单位的结构，显示跨膜区(红色)、内β区(蓝色)、外β区(橙色)和高温高压区(绿色)
显示了二级结构元素
(二)三聚体通道组装
其中两个子单元显示在曲面表示中
(三)与(二)相同的正交视图，从细胞外侧
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abe5983 确定低温电磁结构的融合策略
研究人员使用绿色荧光蛋白标记的构建体来鉴定TMEM206候选物，并选择河豚TMEM206，因为它们与人类氯离子通道有50%的相同序列
邓等
然后纯化全长野生型河豚鱼TMEM206蛋白，并对其进行单颗粒冷冻电镜分析
使用三维重建图，他们揭示了一个具有跨膜域和膜外域的三聚体通道结构
TMEM206形成了一个对称的三聚体，其中每个亚单位包含一个跨膜结构域(TMD)和一个大的细胞外结构域(ECD)，其中跨膜结构域有两个跨膜螺旋TM1和TM2，细胞外结构域富含β结构域，在上层和下层进一步组织了额外的基序
此外，广泛的侧链接触涉及通过范德华相互作用在内部和外部β域
三聚体通道组件在细胞外区域的中间引入了三个侧向开口或侧入口，以可能促进离子和水的通过
细长的侧门延伸到电子捕获检测器-经颅磁刺激检测器连接处，以恢复紧密的包装相互作用
为了克服确定蛋白质结构的任何技术困难，邓等人
融合骨限制干扰素诱导的跨膜蛋白(缩写为BRIL)的碳末端；一种四螺旋束蛋白，广泛用作结晶伴侣，以改善膜稳定性并促进晶体形成
子单元间接口
(一)三聚体界面在胚胎发育的顶端
K267和F238的侧链突出显示
(二)电子海图顶层子单元间界面侧视图
界面中涉及的残留物以棒状表示
(三)两个相邻亚单位之间电子捕获检测器中间的侧门
图中显示了墙壁的表面和残留物
(四)TM1-TM2子单元间接口
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abe5983 离子渗透途径和诱变研究 利用孔隙半径计算，邓等
显示了中央离子传导孔如何包含多个收缩来阻止离子通过
该结构由于高酸碱度缓冲条件(pH 8)而呈现非导电构象
0)用于确定低温电磁结构
由于细胞外区缺乏蛋白质-蛋白质的接触，大而细长的中央前庭可以从侧面进入
蛋白质通道的窄点不干扰离子传导，并且当离子通过三个侧入口时，可以在通道门控周期中保持该窄点
中央门厅和侧入口的内壁的微正静电势也促进了氯离子的吸引
在胞外域-跨膜域(ECD-TMD)连接处，三条链连接到外螺旋，并向内移动以连接内螺旋，从而在胆质层上方产生胞外门
在面向孔隙的位置上的连续结构形成了一个疏水门，该疏水门可以阻止离子传导
为了支持结构性发现，邓等人
对关键的活孔残留物进行诱变研究
当他们用丙氨酸或酸性残基取代保守的碱性残基时，酸激活的氯电流被消除了
相反，精氨酸替代保留了通道功能，进一步支持阴离子选择性过滤器中正电荷的要求
例如，I310结构域形成了跨膜门的关键成分，而另一种被称为K320的结构形成了阴离子选择性过滤器
这项工作支持人类和河豚直向同源物之间的结构守恒，以代表氯离子通道的生理学相关模型
离子渗透途径
(一)TMEM206EM和中心离子传导孔的结构，以表面表示
产生缩窄的残基被突出显示和标记
显示了侧面入口
(二)中心离子传导孔及半径估算(右图)
通道的表面表示，由表面静电势着色(红色，5kt/e；白色，中性；蓝色，+5 kT/e)
示侧门和细胞质前庭
(四)胚胎发育-颞下颌关节连接处的胞外门
V101、T301和N303以棒状表示
(五)跨膜门，由I310、G313和M316组成
K320定义的推定选择性过滤器
还显示了K320的侧链密度，轮廓为6
5 σ
细胞外酸碱度为7时的电流密度
3 (G)和4
TMEM206突变体在+100毫伏时为6(氢)
通过在0毫伏的保持电位下使用从100至+100毫伏的电压斜坡500毫秒来记录全细胞膜电流
(一)酸碱度为4时的电流密度比
6至pH 7
三
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abe5983 构造趋同 TMEM206的拓扑、结构和组装代表了上皮钠通道(ENAc)/脱胚蛋白超家族离子通道的拓扑、结构和组装，包括酸敏感离子通道(ASICs)；尽管两个通道之间缺乏明显的氨基酸序列同源性
带相反电荷的钠离子和氯离子的三聚体通道，仍然有一个共同的核心结构，两侧有两个跨膜螺旋
研究小组注意到，在通道激活后，中央前庭和跨膜孔之间的胞外门是如何被扩大以使离子通过的
虽然上皮钠通道可以通过胞外区的蛋白水解释放抑制肽来激活，但ASICs和TMEM206只能由胞外质子激活
TMEM和AS1CS之间的保守结构特征也暗示了这两种分子类似的门控构象变化
与专用集成电路和ENaC的结构比较
TMEM206 (A)、ASIC1a[蛋白质数据库(PDB): 6AVE] (B)和ENaC (PDB: 6BQN) (C)的亚基结构
域的颜色相似
(四)TMEM206的叠加，如(一)所示，ASIC1a为青色
(五)三聚体TMEM206通道及其中心离子传导孔
使用程序HOLE估计孔隙，并用彩色点描绘(孔隙半径:红色科学进展，doi: 10
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abe5983 前景 通过这种方式，邓曾勤和他的同事们使用单粒子冷冻电子显微镜来确定完整膜蛋白的结构，这是传统的x光结晶学所不能达到的
由于低对比度和信噪比，实现小尺寸膜蛋白的近原子分辨率仍然是一个重大的技术挑战
邓等
获得了3
5埃分辨率的通道结构，通过融合一个小的结晶伴侣BRIL来提高其他次优膜蛋白的稳定性，以促进晶体堆积
基于保守的核心结构，通道对阳离子或阴离子具有选择性，并经历类似的门控构象变化
这项工作建立了一类新的氯离子通道，为细胞和结构生物学的进一步功能和力学研究形成了一个新的框架
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