作者:Thamarasee Jeewandara，Phys
（同organic）有机 掺Tb3+的移液管发出绿色荧光
(一)从(14)中部分提取的Tb3+[的部分能级图]
(二)激发(蓝色)和发射(绿色)光谱为3
1 mol %掺Tb3+玻璃
对照(顶部)和掺Tb3+玻璃毛细管(底部)的宏观彩色照片
图片来源:东京大学池谷佑司
对照(左)和掺Tb3+玻璃移液器(右)尖端的亮场单色(上)和荧光(下)图像(488纳米激光激发，25毫瓦)
由掺Tb3+玻璃制成的移液管发出绿色荧光
图片来源:友川冈本，东京大学和军藤大学
掺Tb3+移液管尖端的扫描电子显微镜图像
图片来源:俊藤大学Hiroyuki Hioki
对照(黑色)和掺Tb3+移液器(绿色)的移液器阻力
矩形显示了中间值以及第25和第75个百分点，胡须显示了第10和第90个百分点
n = 48支移液器，学生测试
(G)与(F)相同，但移液器电容不同
n = 7至8支移液器，学生测试
学分:科学进步，doi:10
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abd2529 光学研究和操作通常构成生物实验的核心
在《科学进展》杂志上发表的一份新报告中，友川·奥卡马托和日本东京大学的一组药物科学、神经科学、医学、物理学和人工智能的科学家介绍了一种新的硼硅酸盐玻璃材料，其中含有稀土离子铽(ⅲ)(Tb3+)
这种材料在蓝光激发下发出绿色荧光，很像绿色荧光蛋白，在生物研究环境中具有广泛的兼容性
使用掺铽玻璃制成的微管
用于单细胞电穿孔、单细胞转录组分析和实时荧光显微控制下的膜片钳记录实验的靶向绿色荧光蛋白标记细胞
该玻璃在红外激光激发下还显示出潜在的三次谐波生成，可用于体内新皮层中荧光标记神经元的在线光学靶向
这样，掺铽玻璃简化了生物实验的多个步骤，在生物医学研究中有更广泛的应用
在体内进行光学研究 活体组织内的光学研究和细胞操作在生物学研究中很普遍，能够揭示细胞和细胞内通讯的各种特性
虽然基因标记已经能够识别表达荧光蛋白的细胞，但是由于玻璃在可见范围内没有荧光，所以使用玻璃吸管来获得荧光标记的细胞仍然是困难的
为了解决这些技术问题，奥卡马托等人
介绍了硼硅酸盐玻璃的新组成
稀土离子显示出独特的荧光发射，在可见光谱中具有尖峰
该团队专注于铽(ⅲ)(Tb3+)的研究，这种物质具有复杂的能级结构，理论上有望发出绿色荧光
激发波长接近人眼的最高可见度，接近绿色荧光蛋白的可见度
因此，由掺铽玻璃制成的移液器可用于生命科学中的荧光靶向单细胞操作
使用掺Tb3+的移液管进行荧光靶向单细胞电穿孔和转录组分析
使用掺Tb3+的移液管进行单细胞基因电穿孔
在器官型培养物中，将含有PCmv-TDTomotive载体的掺Tb3+移液管附着于EGFP阳性海马锥体细胞(顶部；施加电脉冲
48小时后，目标神经元表达TD番茄(底部)
比例尺，20微米
(二)使用掺Tb3+移液器的贴片序列
将掺有Tb3+的移液管连接到转基因小鼠皮质急性切片中绿色荧光蛋白阳性的γ-氨基丁酸能中间神经元上，并通过抽吸提取RNA(顶部)
比例尺，50微米
绿色荧光蛋白阳性和绿色荧光蛋白阴性细胞的百万分之一转录本(底部)
灰点表示所有检测到的基因转录物
红点是代表性的独特基因转录物，绿色荧光蛋白阳性细胞的Pvalb和Gad2 (GAD65)，非绿色荧光蛋白阳性细胞的Mef2c和Slc17a7 (VGLUT1)
图片来源:友川冈本，东京大学和军藤大学
学分:科学进步，doi:10
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abd2529 掺铽玻璃的研制及实验
该团队使用3
1摩尔百分比(摩尔%)氧化铽(Tb2O3)
掺铽(Tb3+)的玻璃发出肉眼可见的绿色荧光，即使在室温下也是如此
掺Tb3+的玻璃在484 nm波长处有吸收峰，这在没有铽的普通硼硅酸盐玻璃中没有观察到
科学家们生产了玻璃毛细管和移液管，其中模制玻璃继续发出绿色荧光
利用扫描电子显微镜，研究小组检查了移液器吸头是否有任何可能影响电生理记录质量的异常现象
Okamato等人
接下来使用新的微管进行单细胞电穿孔，将红色荧光蛋白(tdTomato)导入大鼠器官型海马切片结构中的神经元
他们用同样的光学仪器观察了含有红色染料载体和锥体细胞的移液管，锥体细胞用增强的绿色荧光蛋白做了最低限度的标记
科学家将移液管尖端附着在细胞上，并施加电脉冲进行电穿孔，以促进48小时后红色染料的表达
此后，研究小组用移液管在转基因小鼠的小鼠初级运动皮层的急性切片中进行单细胞核糖核酸测序
使用掺Tb3+的移液器在体外进行荧光靶向膜片钳记录
(一)在膜片钳记录过程中使用掺Tb3+移液管(绿色)从EGFP阳性培养的海马神经元(绿色)获得的尼普考圆盘共焦图像，移液管中装有Alexa Fluor 594(红色)
细胞被捕获在细胞附着模式(顶部)，然后保持在全细胞模式(底部)
比例尺，20微米
(二)用掺Tb3+的移液器从急性海马脑片的CA1锥体细胞记录的由电流注射(上图)、自发诱发电位(中图)和自发诱发电位(下图)诱发的动作电位的典型波形
(三)使用掺Tb3+的移液器进行靶向树枝状膜片钳记录
通过体细胞全细胞记录，在细胞内用Alexa Fluor 488加载第5层锥体细胞，并在Nipkow-disk共聚焦显像下，使用掺Tb3+的移液管对其顶端树突进行进一步的全细胞记录
比例尺，20微米
侵入后，通过掺Tb3+的移液管(右上)在细胞内装载Alexa Fluor 594，使树突可见
掺Tb3+的移液管记录反向传播的动作电位，随后在躯体中诱发动作电位(右下方)
图片来源:友川冈本，东京大学和军藤大学
学分:科学进步，doi:10
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abd2529 使用新的微量移液器进行体外膜片钳记录 研究人员接下来对海马神经元的原代培养物进行了膜片钳记录，这些神经元用掺铽的移液管稀疏地标记了绿色荧光蛋白，移液管中装有红色荧光染料(Alexa Fluor 594)
移液管成功地将染料填充到目标细胞中，并将它们保持在全细胞配置中
研究小组将同样的方法应用于急性脑切片制备，其中神经元位于比培养神经元更深的不透明组织中
当奥卡马托等人
使用掺铽移液器修补急性海马切片中的锥体细胞，神经元对短暂电流注射的反应显示正常的动作电位
在电压钳配置下，细胞表现出正常的自发兴奋性和抑制性突触后电流
微管可用于长期稳定的记录，也可用于轴突的记录
研究小组使用目标树突的设置记录了反向传播的动作电位
掺Tb3+的移液管在1300纳米激光激发下发出THG
(一)亮场中掺Tb3+移液管尖端的代表性图像(上图)、975纳米激光激发下的双光子荧光(中图)和1300纳米激光激发下的三光子谐波发射(下图)
中间和底部图像是通过每像素2 μs的水平扫描和z堆叠获得的
通过495-540纳米带通滤波器的激发光谱
插图显示了975纳米激发时的荧光衰减曲线
(三)与(二)相同，但通过410-450纳米带通滤波器
使用单色仪测量1300纳米激发时的发射光谱
THG强度作为1300纳米激光功率的函数的双对数图
回归线的斜率为3
(六)对照(顶部)和掺Tb3+移液器(中间)尖端的THG图像
图像是z堆叠的
下图描述了对照(黑色)和掺Tb3+移液器(紫色)的THG强度
垂直虚线表示尖端位置
掺Tb3+的移液管(紫色)的THG强度强于对照移液管(黑色)
矩形显示了中间值以及第25个和第75个百分点
n = 5支移液器，学生测试
图片来源:东京大学的泰佩·埃比纳
学分:科学进步，doi:10
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abd2529 使用掺铽移液管进行体内膜片钳记录 Okamato等人
接下来用波长约为铽单光子激发峰(484 nm)两倍的红外光表征掺铽玻璃的非线性多光子激发
通过495至540纳米的带通滤波器使用光电倍增管，研究小组捕捉到了掺铽移液管发出的绿色荧光
发射在激发波长为975纳米时达到峰值，表明对应于该值的激光波长通过双光子吸收过程激发玻璃
科学家们还通过一个410-450的带通滤波器发现了另一个在1300纳米激发的明亮信号，并认为该信号可能来自三次谐波产生(THG)
基于微管的强THG信号
用多光子激光显微镜进行体内全细胞膜片钳记录
他们同时使用细胞和掺铽移液管，分别在1040纳米和1300纳米进行双激光照射，并记录电流钳配置下的注射诱导动作电位和自发膜波动
基于THG的使用掺Tb3+移液器的体内膜片钳记录
(一)体内膜片钳记录的多光子图像，由掺Tb3+的移液管的THG引导，以标记有TdTomotive的细胞为目标，该细胞受到1040纳米激光(红色)的双光子激发
使用1300纳米激光(绿色)获得掺Tb3+移液管的THG
(二)用掺Tb3+的移液管记录通过向麻醉小鼠的初级运动皮层(顶部)的2/3层锥体细胞内注射阶跃电流(底部)诱发的动作电位
(丙)用掺三丁基锡化合物的移液管记录自发膜电位
图片来源:东京大学的泰佩·埃比纳
学分:科学进步，doi:10
1126/sciadv
abd2529 生物医学研究展望 通过这种方式，友川·奥卡马托和他的同事发明了一种掺铽玻璃，它发出的绿色荧光信号强到肉眼可见
该材料具有与传统硼硅酸盐玻璃相似的特性，并且不显示光漂白或细胞毒性
新的微管允许荧光操作，如单细胞电穿孔的光学靶向、单细胞核糖核酸测序和电生理记录
该玻璃还在三光子激发下发出三次谐波，适用于体内操作
因此，掺铽玻璃为生物医学研究的多种目的提供了一个平台，包括迄今为止常规的膜片钳记录，以打开生命科学的新前沿
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