神户大学 图1:数字全息显微镜的光学系统
学分:神户大学 由神户大学的MATOBA Osamu(先进和综合研究组织)教授领导的一个研究小组已经成功地基于数字全息术创建了活细胞的三维荧光和相位成像
他们用细胞核中带有荧光蛋白标记的植物细胞来演示这种成像系统
该小组由项目助理教授马诺基·库马尔和助理教授权相宇(均来自系统信息学研究生院)、教授AWATSUJI Yasuhiro(京都理工学院)和副教授TAMADA Yosuke(宇都宫大学)组成
这项技术将为生命科学领域不可或缺的活细胞成像奠定基础
人们还期望使用这种技术来可视化植物中的干细胞过程将增加我们对它们的理解
这些研究结果发表在5月15日由斯普林格自然杂志出版的《科学报告》杂志上
研究背景 光学显微镜发明于16世纪末，英国科学家罗伯特·胡克在17世纪中叶首次发现细胞
本发明已经发展成新技术，例如相衬显微镜(1953年诺贝尔物理学奖)，其允许观察活细胞而不需要对它们进行染色，以及荧光细胞成像，其中使用荧光蛋白标记特定分子(2008年诺贝尔化学奖)并在活细胞中观察
这些已经成为生命科学和医学领域观察的重要工具
图2:小立碗藓的3D荧光成像结果
下图:黄色箭头表示聚焦核的荧光图像
学分:神户大学 相位成像利用光通过生物样本时光学长度的差异来揭示其结构信息
荧光成像提供关于生物样品中特定分子的信息，并能揭示它们的功能
然而，细胞内的结构和运动是复杂的
可视化包含相位和荧光成像的多维物理信息的能力对于理解这些方面是有用的
一个能够同时从三维活细胞中即时产生各种物理信息的成像系统将成为生物学创新的基础技术
本研究构建的混合多模态成像系统可以一次性获得相位和荧光三维信息
它使研究人员能够使用单个平台定量和同时可视化生物样本的结构或功能信息
研究方法 在这项研究中，研究人员构建了一个多模态数字全息显微镜，可以同时记录样本的荧光信息和相位信息(图1)
这使用数字全息术作为基础，由此来自物体的干涉光信息被记录，然后由计算机进行的光学计算被用于产生关于物体的三维空间信息
研究中的显微镜由两种不同的光学系统组成
首先，全息三维荧光成像系统，如图1右侧所示
为了获得三维荧光信息，使用空间光调制器将荧光分子发出的荧光分成两个相互干涉的光波
在这一点上，物体光的三维信息是通过给光波之一一个稍微不同的曲率半径和传播方向来保存的；同时，两个光波在一个共享的光路上(大部分沿同一轴行进),允许进行时间稳定的干涉测量
该光学系统在本研究中被公式化，首次阐明了记录的干涉强度分布
这个公式使研究人员能够找到改善重建荧光图像质量的实验条件
通过应用这种荧光三维全息系统，他们能够生成活细胞及其结构的三维图像
活细胞的分子和结构用荧光蛋白标记，允许通过这种新的三维荧光显微镜观察它们的动态行为
图3:小立囊泡的三维相位成像结果和来自不同重建平面的重建相位图像
右边是三维地图
这项研究开发的成像技术能够在单次拍摄中生成三维图像，而不需要扫描，迄今为止，通过激光扫描生成三维图像花费的时间相对较长
接下来，如图1左侧所示，是全息三维相位成像系统
活的植物细胞由细胞核、线粒体、叶绿体和薄壁细胞等组成
从相位差(光程长度)可以看出这些元件的结构
在该系统中，采用马赫-曾德尔干涉仪允许使用参考平面波，使得能够容易地获得每个被测物体的最佳干涉条纹
这种数字全息显微镜是通过统一荧光和相位测量系统而创造的
随后，这种显微镜被用来观察活的植物细胞
进行了一项实验，以证明通过应用空间三维和(一维)时间轴进行四维观测是可能的
使用小立碗藓和平均尺寸为10微米的荧光珠
图2和3显示了苔藓的同时三维荧光和相位成像的实验结果
图2 (b)显示当使用传统的全视场荧光显微镜时，七个细胞核是可见的
在这七个核中，编号为1、2和4的核处于聚焦状态，然而，不同深度位置的核却不是这种情况，因为它是具有广泛模糊的弱荧光图像
在本研究提出的解决这一问题的方法中，荧光光波信息是从图2 (c)中的荧光全息图中提取的
基于这一信息，数值菲涅耳传播算法可以在任何深度或距离获得重构的荧光图像
因此，在不同深度的多个荧光核的聚焦图像可以从单个图像恢复而无需扫描
图2 (d)、(e)和(f)显示了三个不同平面的重建图像
(d)和(e)之间的轴向距离为10微米，(e)和(f)之间为15微米
黄色箭头表示聚焦的原子核
可以看到荧光图像中的七个核中的哪一个在三个平面上聚焦
图3显示了三个平面在不同深度的定量相位分布
可以看到单个叶绿体(细胞边缘有许多叶绿体，如图3 (b)中的红色峰所示)
根据测量的定量相值计算的电池厚度约为17微米，与其他参考值非常接近
图4:溶液中漂浮的荧光珠
学分:神户大学 在图4中，你可以看到荧光珠(大约10微米大小)漂浮在溶液中
使用所提出的方法从记录中产生相位和荧光信息
珠子也在深度方向上移动，因此可以通过改变重建距离来恢复它们的三维位置，以保持它们在焦点上
在这项研究中，开发了一种多模态数字全息显微镜，能够同时进行三维相位和荧光测量
由于能够同时进行定量相位和荧光成像，相信该方法将作为活体生物组织和细胞可视化的新基础技术
特别是，已经表明这种显微镜可以应用于复杂的植物细胞
它可以用来获得对植物干细胞形成过程的多样化理解，植物干细胞比动物细胞更容易繁殖
在未来，有可能利用这些信息通过光刺激来控制干细胞的过程
通过建议的成像和未来的刺激实现的有效的植物繁殖和生长可以应用于食品栽培系统的开发
这项技术可以通过进一步提高光利用效率来开发
在数字全息术中，有必要在空间上加宽光束直径，将其分成两部分，然后再次重叠，以便利用两条光路之间的干涉
因此，还需要增加荧光能量，以便由图像传感器观察到
为了实现这一点，需要大量的光能来照亮活细胞，然而，由光引起的细胞损伤将是一个大问题
据认为，体积全息图可以用来提高光利用效率，同时避免细胞光毒性
另一个问题是重建的三维分布延伸到光传播方向(物体的深度方向)，降低了轴向分辨率
研究人员正在研究使用深度学习和过滤的方法，以抑制深度方向的这种扩展并提高图像质量
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