马克斯·普朗克学会
冷冻停止前活细胞中癌蛋白和相应肿瘤抑制物的荧光显微术(左)和冷冻停止下获得的超分辨率图像(右)
学分:@分子生理学MPI 荧光显微镜具有独特的能力，可以在跨越四个数量级的尺度上观察细胞过程
然而，它在活细胞中的应用从根本上受到定义其生存状态的分子的非常快速和不断运动的限制
更重要的是，光与荧光探针的相互作用使得能够观察分子过程，这导致了它们的破坏
多特蒙德马克斯·普朗克分子生理学研究所系统细胞生物学部门开发的显微镜实时观察过程中的细胞超快速冷冻停滞技术，现在可以绕过这些基本问题
该方法的核心是以每秒20万摄氏度到-196摄氏度的巨大速度冷却活细胞
这使得细胞生物分子在停止时能够以其自然排列方式得到前所未有的保存
在这种低温状态下，分子运动和光诱导的破坏被停止，从而能够观察到原本看不见的生命分子模式
我们身体中几乎100万亿个细胞是活的，因为它们通过持续的能量消耗保持自己处于永久活跃的状态
因此，构成细胞的微观模式来源于数十亿纳米大小的生物分子不断变化的行为，如蛋白质、脂质、核酸和其他分子，它们以一种看似无组织的方式四处奔忙
为了观察更大规模的组织是如何从这种持续不断的活动中出现的，生物分子物种可以选择性地配备荧光探针
这些荧光分子是光子催化剂:它们吸收高能光子(例如
g
蓝光)并随后发射较低能量(红移)的光子
这些光子可以通过显微镜成像，不仅可以精确定位标记的生物分子，还可以报告局部分子反应
然而，光诱导的探针破坏和非常重要的分子运动的模糊是两个基本问题，它们阻碍了对生命的分子过程如何在细胞尺度上产生结构的观察
荧光显微镜的不确定性原理 荧光显微镜对某个结构或分子的分辨能力基本上取决于从这个结构中收集到的光量
这类似于试图在夜空中看到星星
只有那些明显比周围环境亮的恒星才第一眼看得见
如果我们用长曝光时间拍摄夜空，会有更多的星星变得可见，但是会因为地球的自转而变得模糊
类似地，在荧光显微镜中，可以延长曝光时间以增加检测到的光量
然而，微观结构从来不会静止不动，而是表现出随机和定向的运动
延长曝光时间从而导致结构模糊
然而，在这种情况下，小结构的移动比荧光团的光子催化快得多，因此不能通过创建更好的检测器或更强的照明来提高精度
更有甚者，光子催化过程会产生有毒自由基，不仅破坏分子过程并最终杀死细胞，还会破坏荧光分子本身
这最终限制了可以从活细胞中的探针收集的光量
第一作者简·休宾格尔在装置后面的超快速冷冻捕获显微镜
学分:@分子生理学MPI 这个解决方案确实非常酷 Philippe Bastiaens团队的Jan Huebinger现在已经开发出一种技术，可以在荧光显微镜上直接观察活细胞动态的过程中，在几毫秒内的任何感兴趣的时间点，阻止分子的活动模式
这样，运动模糊和光解这两个基本问题就可以同时被忽略
这种停止是通过极快的冷却到非常冷的温度(-196℃)来完成的，以至于分子运动实际上停止了
逮捕必须非常迅速，原因有二
首先，如果停滞太慢，定义活细胞的通电微观模式会分裂成死亡状态
其次，逮捕的速度必须快于结冰的过程，因为结冰会破坏细胞
当e
g
西红柿冷冻后变得非常软
在0℃到-136℃的临界温度范围内，冰的形成速度极快
然而，非直观地，在非常低的温度下(低于-136摄氏度)，冰晶实际上不能再形成了，因为水分子的运动实际上也停止了
这实际上意味着，冷却速度必须超过每秒10万摄氏度
研究人员通过开发一种与显微镜集成的超快速冷却装置，掌握了这一技术挑战，在显微镜下，液氮(-196℃)的低温在高压下加速到金刚石上
同一颗钻石的反面也装有含有细胞的样品
高压爆发与金刚石的卓越导热性相结合，使其能够实现必要的高冷却速率，从而将细胞抑制在-196℃的原始状态
这不仅解决了运动模糊的问题，而且阻止了光化学破坏
这开启了无限曝光的可能性，突出了在噪音中被掩盖的分子模式
让看不见的变得可见 超快速冷冻捕获允许使用通常具有破坏性的高激光功率以数十纳米的分辨率分析天然分子模式，否则这些模式是不可见的
更重要的是，由于在-196℃没有光解，相同的滞留细胞可以通过不同的显微镜观察方式来测量从分子到细胞尺度的模式
这项新技术由此导致了癌蛋白和肿瘤抑制蛋白的纳米共组织的发现，这种共组织保护细胞不表现出恶性行为
“这是荧光显微术的一个有利步骤，特别是超分辨率显微术和显微光谱术的结合，允许在多个尺度上绘制细胞中的分子反应
它将改变我们观察细胞中分子组织和反应模式的方式，从而为生物的自组织能力提供更多的见解。”
这项研究发表在科学进展
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