作者:Phys Thamarasee Jeewandara
（同organic）有机 荧光团的寿命对染色质复制时间的依赖性
用AlexaFluor 546标记的早期、中期和晚期S期DNA复制位点的代表性荧光寿命图像
相应的寿命直方图如图1所示
S3
整个细胞核寿命分布的彩色编码图像
c .用FLIM方法测量在不同S相窗口复制的染色质压缩的示意图
用于标记早期、中期和晚期S期DNA复制位点的AlexaFluor 546的平均荧光寿命
误差线对应于标准偏差
学分:光:科学与应用，doi: 10
1038/s 14377-021-00664-w 光学成像对于研究细胞基因组的结构和功能是有用的，但是对非常复杂和不规则的压缩DNA聚合物成像是有挑战性的
在一份发表在《自然·光:科学与应用》杂志上的新报告中
列夫琴科和一组来自中国、波兰和美国的研究人员
S
，开发了荧光寿命成像(FLIM)，以在DNA压缩过程中推进基因组结构
在这项工作中，他们使用了两种机制，其中一种依赖于掺入到DNA中的荧光探针的局部折射率，另一种依赖于同样掺入到DNA中的供体和受体荧光团之间的福斯特共振能量转移过程(FRET)
该团队利用细胞培养验证了所提出的机制，揭示了基因组DNA的基因丰富库和基因贫乏库的显著差异
荧光成像技术
荧光显微镜是研究细胞分子结构的关键技术，包括激光扫描共聚焦显微镜和多光子成像
随机光学重建显微术和光活化定位显微术以及其他超分辨率成像技术的出现，使得细胞结构的可视化能够彻底改变细胞生物学的研究
然而，研究生物分子的胞内分布和相互作用仍然具有挑战性，因此研究人员发展了荧光寿命成像(FLIM)方法
在这项工作中，列夫琴科等人
提出并推进了FLIM方法，以收集新的信息层来研究三维细胞结构，如基因组结构组织
虽然非编码DNA片段位于密集的结构域中，但富含基因的序列在构型上相对宽松，以提供对催化RNA合成和转录后修饰的可溶性蛋白质的通路
在第一次提出的基于FLIM的分析中，研究小组使用了荧光寿命和局部折射率之间的平方相关性，以响应DNA压缩密度
在第二种方法中，他们在掺入DNA链的荧光标记核苷酸之间使用了FRET
标记染色体区域的FLIM成像
在早期S期同步的细胞用BrdU脉冲标记，并在随后的细胞周期中追踪，以产生标记染色体区域的分离
示出了代表性的荧光强度(a)、连续(b)和离散(c，d)荧光寿命图像
学分:光:科学与应用，doi: 10
1038/s 14377-021-00664-w 作为DNA压缩函数的折射率 蛋白质在基因组染色质中的分布是不均匀的，并且与DNA压缩(DNA包装或浓缩)水平相关，以产生密集的异染色质区域
DNA和蛋白质对染色质的折射指数同样有贡献，因为它们都以接近的质量比存在
因此，通过FLIM方法来探究染色质压缩的水平是很有诱惑力的
在实验过程中，他们用一种DNA聚合酶的抑制剂蚜虫菌素来同步细胞
当细胞进入S期时，他们将细胞与溴脱氧尿苷(Brdu)一起孵育，Brdu是一种卤化核苷酸，可以很容易地结合到新合成的脱氧核糖核酸链中
掺入的Brdu没有明显改变基因组功能，但它们永久保留在基因组DNA中
在接下来的一系列实验中，他们研究了超过细胞周期S期的染色质压缩
基于标签隔离，列夫琴科等人
用于减少拥挤和有效图像分析的可视化个体染色体区域
数据支持染色体边界富含松散紧密的染色质纤维的观点
研究基因组DNA压缩的FLIM-FRET分析示意图
一个基本的FLIM-弗雷特机制
通过掺入荧光团连接的核苷酸直接标记基因组DNA
染色质浓缩水平和荧光共振能量转移效率之间的关系
在细胞周期的S期同时(d)和顺序标记染色质区域(e)的方案
学分:光:科学与应用，doi: 10
1038/s 14377-021-00664-w HeLa细胞核基因组DNA压缩的FLIM-FRET图谱
复制细胞在S期早期和中期分别用AlexaFluor 546(供体)和AlexaFluor 647(受体)荧光团标记
a .存在和不存在AlexaFluor 647时，AlexaFluor 546在原子核中寿命分布的代表性图像
在受体存在的情况下，供体的荧光寿命由于FRET (b)而缩短
根据供体荧光团寿命分布计算细胞核中的FRET效率分布
颜色图是根据经验从FRET分布直方图中定义的(如(d)所示)
受体不存在和存在时供体寿命的代表性直方图
显示三个群体(低、中、高FRET)的FRET分布直方图，用相应的颜色表示
学分:光:科学与应用，doi: 10
1038/s 14377-021-00664-w 理解DNA压缩的福斯特共振能量转移机制 该团队随后通过荧光寿命成像(FLIM)-福斯特共振能量转移(FRET)技术探索了基于FLIM的方法在纳米尺度上探测DNA压缩的适用性
单链DNA标记方法包括用卤代核苷酸如氯脱氧尿苷和碘脱氧尿苷对新合成的DNA进行双重标记，以便通过免疫荧光染色进行选择性检测
与FLIM的折射率作图(荧光寿命成像)相比，这种方法对DNA压缩的变化具有更高的灵敏度
为了理解FLIM-弗雷特实验方法的效率，列夫琴科等人
通过与卤代核苷酸孵育，在早期S期标记复制DNA，然后用荧光团对其进行选择性标记以进行鉴定
在进一步的实验中，他们验证了FLIM-弗雷特方法来探测具有不同复制时间的DNA纤维之间的接近性
然后，研究小组在掺入卤化核苷酸后立即获得荧光强度和寿命图像，或者在几代细胞后，当细胞核中的单个染色体区域可以被清楚地识别时，获得荧光强度和寿命图像
试点实验为FLIM-弗雷特方法在检测DNA压缩方面的独特应用提供了概念验证
而列夫琴科等人
使用免疫标记方案，现有方法也允许基于荧光核苷酸的细胞内递送在活细胞中复制标记染色质
荧光成像和FLIM-FRET方法同时显示同一细胞核中早期和晚期S期复制基因组DNA
(a)方法示意图:在早期S期用CldU和在晚期S期用IdU顺序标记的培养细胞被追踪到随后的第11代细胞中，使得能够用染色的早期和晚期S期标记的染色质可视化分离的染色体区域
(b，c)在卤化核苷酸脉冲后以不同的间隔固定细胞，并对b CldU (AlexaFluor 546，绿色)和c IdU (AlexaFluor 647，红色)进行染色
标记早期和晚期复制染色质结构域后染色体区域形成过程的代表性荧光强度(b–e)、寿命图像(f)和FRET效率(g，h)
学分:光:科学与应用，doi: 10
1038/s 14377-021-00664-w 观点 就这样，斯维特拉娜M
列夫琴科和他的同事提出并验证了两种基于FLIM(荧光寿命成像)的方法来研究DNA压缩和基因活性
第一种方法依赖于荧光团寿命值和局部折射率之间的相关性来检测细胞周期S期内细胞核染色质压缩的变化
相比之下，FLIM-弗特(荧光寿命成像-福斯特共振能量转移)方法更灵敏，能够在纳米尺度上感知DNA压缩
总之，这些光学方法为基因组结构组织的定量研究提供了新的方向
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