作者:Thamarasee Jeewandara，Phys
（同organic）有机 单次荧光全息术的实验实现
荧光剪切全息装置是通过扩展荧光宽视场显微镜获得的，其波前传感器由安装在显微镜出口处的2D 0-π相位光栅和中继成像系统组成
硬孔径阻挡除第一衍射级以外的所有衍射级
学分:科学进步，doi: 10
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abc2508 生物学家通常使用荧光显微镜，因为这种技术具有分子特异性和超分辨率
然而，该方法受到成像限制的限制
在一份关于科学进步的新报告中，马特兹·利贝尔和巴塞罗那科技学院和西班牙马萨诸塞州总医院的一个研究小组
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报道了一种利用单分子灵敏度恢复荧光全电场的成像方法
该团队通过使用15纳米的面内分辨率跟踪单个纳米粒子的三维(3-D)轨迹，实验了用于快速荧光检测的数字全息术的概念
作为概念验证的生物学应用，研究人员对活细胞内细胞外小泡的三维运动进行了成像
活组织中的纳米递送 在这项工作中，李贝尔等人
开发了基于荧光全息术的三维粒子定位，穿过活细胞内的细胞外小泡，并观察到具有活跃转运周期的强受限小泡
为了积极实施微创纳米医学平台，在体内输送货物运输目前是一项重大挑战
纳米粒子和细胞外载体可以被设计成有前途的载体，但是科学家们还不知道这些设备在活组织中的精确行程
为了克服这些挑战，他们必须开发宽视场三维单粒子成像方法，以便在单个粒子到达预定目的地时同时跟踪它们
研究小组先前已经实现了显微术的全息方法，尽管荧光的不相干性不太适合活细胞或单分子成像
相比之下，剪切干涉法是完成动态过程单次记录的一种很有前途的方法
剪切干涉测量背后的基本思想包括自干涉，以获得低至单光子水平的相位梯度，从而实现单次荧光全息术
因此，在这项工作中开发的机制有助于观察跨越微米长度尺度的细胞内易位，为生物学家提供对细胞内机制的更深入的见解
电场重建工作流程
实验获得的离焦200纳米荧光珠的图像，显示剪切诱导的点扩散函数的空间调制
(二)(一)的快速傅立叶变换(快速傅立叶变换)允许通过硬孔径隔离和转移到零频率来隔离x和y维度上的感兴趣的干涉项
(三)从(二)中分离出来的项的快速傅里叶逆变换(iFFT)产生所需的相位梯度
用泊松解算器进行分析2D积分，得到原始相位图像
(五)相位缩放，说明光栅到相机芯片的距离，随后是最终相位和振幅图像的像差校正结果
所有比例尺都相同，0-2π相位环绕仅用于可视化目的；直接获得展开的信息
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abc2508 三维粒子跟踪成像原理及系统验证 该团队使用了一种宽视场荧光显微镜，该显微镜带有由中继成像系统组成的波前剪切传感器
该装置的几何结构确保测量非零相位梯度，并允许李贝尔等人
为了在整个图像上执行单光子自干涉
该团队将荧光聚苯乙烯珠成像为离焦200纳米的粒子，并将强度信息提取为用于相位梯度提取的过滤图像的变元模量
在观察了完整的电场后，他们使用傅立叶光学来校正复杂的散射引起的像差，或者在任意选择的平面上构建图像
该团队专注于三维定位实验，要求在包括Z平面在内的所有维度上恢复感兴趣的发射器的精确位置
计算聚焦的努力表明了确定多个自由扩散荧光粒子的三维位置的精确能力
测试计算聚焦轨迹 概念证明实验
(一)200纳米荧光珠记录4
4焦点上方的微米(上图)通过计算重新聚焦(下图)
插图显示了通过实验获得的同一粒子的焦点对准图像，旁边是穿过各个点光源的切口(白色虚线:焦点对准；粉红色，实心:重新聚焦)
通过用压电台沿已知轨迹移动样品，同时对三个200纳米荧光珠进行3D跟踪(粉色:压电移动；蓝色:单个珠子的重建轨迹；黑色:平均轨迹)
为清晰起见，各个轨迹在x/y方向重叠；z = 0微米对应于处于焦点的粒子
(三)与焦点上方900纳米处获得的典型图像相比，预期的亚衍射限制压电轨迹(粉红色)(左)
得到的y/z和x/z平均轨迹投影(黑色)与压电轨迹(粉色)非常一致，蓝点显示了通过同时跟踪17个单独的荧光珠(右侧)获得的所有位置
基于直方图的定位精度分析得出σx/σy = 15 nm，σz = 21
5 nm(注释S7)
(四)单个ATTO647N分子记录失焦(左)成功计算聚焦(中)
荧光发射的代表性区域(粉色、紫色和蓝色)显示出单个发射器预期的一步光漂白
(五)在(四)中强调的三个区域的光漂白时间轨迹；虚线表示背景等级
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abc2508 为了测试设置背后的计算推理，李贝尔等人
生成一个已知的三维轨迹，并移动一个包含固定荧光珠的样本——同时沿着该路径记录图像
他们恢复了相位和振幅信息，并使用数值传播确定了单个粒子的三维位置
为了量化可接近的Z范围，他们通过实验使单个粒子散焦，然后通过计算重新聚焦图像，以获得大约8米的Z范围内的无伪影测量值
重要的是要确保在三维空间中跨越微米长度尺度的精确纳米尺度定位，以对扩散的纳米尺度粒子成像
荧光全息术满足了这些要求
作为概念的证明，科学家对“全息术”这个词进行了成像，其中每个输入字母的宽度小于50纳米，以获得分辨率良好的输出，这证实了荧光全息术的超分辨率能力
单分子成像和纳米粒子的细胞摄取 该团队通过测量由单个分子组成的样本，展示了荧光全息术在生物重要的超分辨率条件下是如何发挥作用的
尽管在实验装置中荧光强度显著降低，研究小组还是获得了计算聚焦到衍射极限，即使光子水平低至104个光子
他们利用该系统观察了无机纳米粒子的细胞内运输和细胞外囊泡
作为一个模型系统，他们使用了荧光标记的金纳米棒，这种纳米棒是惰性的，因此不会干扰细胞功能，可以在细胞质中积累，这一点通过活细胞的暗场图像得到了验证
该小组通过记录延时荧光图像跟踪粒子的轨迹，并提取相位和振幅项
广泛变化的点扩散函数表明纳米棒存在于相对于焦平面的不同Z位置
活细胞中的三维荧光跟踪
(一)典型的活细胞单粒子追踪实验
(二)饱和荧光图像(粉红色)，覆盖在猴肾细胞相应的亮区图像上
(三)细胞样品乙成像得到的荧光振幅(左)和相位(右)
所有电影都是以100毫秒的曝光时间在总共100帧的时间内以1/20的成像占空比进行记录的，以实现长期成像
为了解决聚焦粒子和离焦粒子之间的大亮度差异，我们显示归一化振幅而不是荧光强度，并将标度限制在0
5，最大值为1
插图:原始、未包裹的相位图像，突出显示图像焦平面上方/下方粒子的凸/凹曲率
(四)从(三)获得的原始振幅图像片段与通过计算传播2微米(上)和2微米(下)获得的图像的比较
(五)通过荧光全息术获得的颗粒在活细胞内扩散的三维轨迹
每个单独的轨迹都有一个单独的比例尺，z位置用颜色编码
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abc2508 该团队对细胞中的每个纳米棒进行了三维定位，并在100帧的观察中重建了粒子轨迹，以获得六个代表性类别，其中一些粒子在200秒的观察时间内是不动的，而其他粒子在几微米内自由扩散
剩余的粒子显示出束缚态和扩散态
这样，潜在的荧光全息方法可以精确地确定三维位置
细胞摄取和细胞外小泡的主动转运 Liebel等人
然后通过将HeLa细胞与荧光标记的细胞外小泡孵育，研究细胞外小泡在活细胞内的主动三维转运
他们每四秒钟采集一次荧光全息图，通过自动和手动轨迹的结合来重建单个电动汽车的三维轨迹，并将三维电动汽车位置联系起来
Liebel等人
将荧光全息图的延时振幅投影与同时记录的单个细胞的亮场图像重叠，以显示大多数上皮细胞是如何定位在粘附细胞的边缘的
观察和计算表明，电动车辆被困在一个区域内，将它们的运动限制在特定的体积内；很可能属于细胞骨架
重建活细胞内单个细胞外小泡的三维轨迹
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abc2508 前景 通过这种方式，Matz Liebel和他的同事设计了一种大视场单次荧光全息术方法，允许在大约8微米的Z范围内进行三维单粒子跟踪。
为了证明这一概念，该团队实施了一个简单的实验装置，优化了光子吞吐量
优化的特征使得荧光全息术成为实时研究粒子跟踪的理想方法
该团队展示了三维单粒子跟踪，并观察了活细胞中纳米级物体的运动，如荧光标记的金纳米棒和EVs(细胞外小泡)
金纳米棒仅聚集在细胞质中，而不在细胞核中内化，而细胞外基质聚集在贴壁细胞的边缘，形成拥挤效应
Liebel等人
期望进行额外的染色以识别细胞内细胞骨架，从而将细胞内结构与细胞外小泡的运动联系起来
这些努力将阐明细胞内货物运输和颗粒内化的精确机制，并在纳米医学中有重要应用，以回答生物学和医学中的关键问题
该机制同样适用于进行其他体积成像方法，以跟踪组织内部和生化钙成像
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