中国科学院 STED-SREF能源图
STED-SREF光谱学结构
这里使用罗丹明800 (Rh800)的腈模式
Rh800染色大肠杆菌的SREF/STED-SREF成像
泵波长设置在836 nm(腈模式的非共振)和838 nm(腈模式的振动共振)的大肠杆菌细胞
受激发射损耗(STED)与SREF成像的直接耦合不能实现期望的分辨率提高
反斯托克斯荧光背景(显示在SREF泵=836纳米)在阻止直接采用超分辨率荧光技术方面具有不期望的作用
信用:熊汉清、钱乃馨、淼、赵志伦、、
超越衍射极限的真正超分辨率成像仍然是远场拉曼显微术的主要挑战，特别是在生物应用中
利用受激拉曼激发荧光(SREF)作为超灵敏的振动对比，哥伦比亚大学的一个团队最近发明了一种新的超分辨率振动显微镜
他们的新方法开辟了生物系统的超分辨率、纳米光谱分辨率多色振动成像
长期以来，人们一直致力于发展拉曼显微术的超分辨率成像技术，这种技术与荧光技术相比，具有化学特异性的内在优势
尽管认识到重要性和广泛的研究努力，由于传统拉曼散射灵敏度的不足，光学远场生物系统的真正超分辨率(定义为衍射无限制)拉曼成像仍然具有挑战性
因此，那些报道的超分辨率振动成像方法是基于拉曼跃迁的激发饱和、耗尽或高阶非线性
这需要非常强的激光功率来实现适度的分辨率提高(通常小于2倍)，这抑制了其在生物应用中的效用
在《光:科学与应用》杂志上发表的一篇新论文中，由美国哥伦比亚大学的韦敏教授领导的一组科学家开发了一种新颖的超分辨率振动显微镜，利用受激拉曼激发荧光(SREF)作为超灵敏的振动对比
SREF将振动激发与荧光检测相结合，实现了灵敏度低至单分子的全远场拉曼光谱
然而，由于反斯托克斯荧光背景的存在，受激辐射耗尽(STED)与SREF成像的直接耦合不能实现超分辨率成像，反斯托克斯荧光背景不能被STED光束耗尽
a .常规SREF激发获得的Rh800腈模式的原始SREF谱(红色曲线)和相应的调频-SREF激发获得的无背景调频-SREF谱
Rh800染色大肠杆菌的调频SREF成像和电子预共振受激拉曼散射成像
大肠杆菌细胞
沿着(b)中相应的白色虚线的调频-SREF和epr-SRS的相应强度分布
使用的两种SREF染料的化学结构
e，两种染料在水中的吸收光谱(实线曲线)和发射光谱(虚线曲线),这对于常规荧光光谱是不可分辨的
这两种染料的腈模的调频SREF光谱
彩色调频SREF成像
酿酒细胞
信用:熊汉清、钱乃馨、淼、赵志伦、、
在这项新工作中，研究小组设计了一种调频策略来消除这种宽带背景
通过暂时调制目标振动共振的激励频率，但仍在背景的宽线宽内，它们可以对纯振动信号(但不是在背景上)产生强度调制
无背景振动信号可以随后通过锁定检测来解调
与典型的原始SREF频谱相比，调频SREF获得的频谱代表纯SREF信号，这使得高对比度无背景SREF成像成为可能
他们进一步合成了新的同位素编辑的SREF染料，以促进具有鲜明振动对比的多色调频SREF生物成像
两种振动颜色由调频SREF分离，串扰最小，这在常规荧光显微镜下几乎是不可能的
振动成像的这种化学特异性对于多重光学成像具有独特的优势
一、STED-调频-SREF显微镜系统图
同一个Rh800染色的大肠杆菌的图像
用调频SREF显微镜和STED调频SREF显微镜观察大肠杆菌细胞及相应的沿虚线的强度分布
c .通过调频-SREF显微镜和STED-调频-SREF显微镜对相同化合物-A染色的Cos7细胞核成像，并沿虚线显示相应的强度分布
信用:熊汉清、钱乃馨、淼、赵志伦、、
最后，通过将STED与无背景调频SREF相结合，他们用STED调频SREF实现了高对比度超分辨率振动成像，其空间分辨率仅由信噪比决定
他们展示了中等激光激发功率下生物系统的分辨率提高了两倍以上
随着仪器和成像探头的进一步优化，STED-调频-SREF显微术凭借其卓越的分辨率、高灵敏度、独特的振动对比度和生物相容性激发能力，有望帮助实现广泛的生物应用
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